Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris
Summary
Présenté ici est un protocole pour la suppression efficace de la réplication du virus de l’hépatite B (HBV) chez les souris en utilisant le transfert de cellules adoptives (ACT) de cellules souches dérivées des lymphocytes T spécifiques à l’antigène viral (Ag). Cette procédure peut être adaptée pour l’immunothérapie act-basée potentielle de l’infection de HBV.
Abstract
L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est un problème de santé mondial. Avec plus de 350 millions de personnes touchées dans le monde, l’infection par le VHB demeure la principale cause de cancer du foie. Il s’agit d’une préoccupation majeure, en particulier dans les pays en développement. L’échec du système immunitaire à monter une réponse efficace contre le VHB conduit à une infection chronique. Bien que le vaccin contre le VHB soit présent et que de nouveaux médicaments antiviraux soient créés, l’éradication des cellules de réservoir de virus demeure un sujet de santé majeur. Décrit ici est une méthode pour la génération de l’antigène viral (Ag) -spécifiques CD8– lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (c.-à-d., iPSC-CTLs), qui ont la capacité de supprimer la réplication du VHB. La réplication du VHB est efficacement induite chez la souris par injection hydrodynamique d’un plasmide d’expression HBV, pAAV/HBV1.2, dans le foie. Ensuite, hBV surface Ag-spécifique souris iPSC-CTLs sont transférés d’adoption, ce qui supprime considérablement la réplication du VHB dans le foie et le sang ainsi que empêche l’expression HBV surface Ag dans les hépatocytes. Cette méthode démontre la réplication du VHB chez les souris après injection hydrodynamique et que les CTL viraux dérivés de cellules souches peuvent supprimer la réplication du VHB. Ce protocole fournit une méthode utile pour l’immunothérapie de HBV.
Introduction
À la suite d’une infection aigue, le système immunitaire adaptatif (c.-à-d. l’immunité humoristique et cellulaire) contrôle la majeure partie de l’hépatite aigue liée au VHB. Pourtant, un certain nombre de personnes dans les régions où le VHB est endémique ne peuvent pas éliminer les virus et se convertir par la suite en tant qu’individus chroniques. Plus de 25 % des patients chroniques (250 millions de personnes dans le monde) développent une maladie hépatique progressive, entraînant une cirrhose du foie et/ou un carcinome hépatocellulaire (HCC)1. En conséquence, l’éradication des cellules infectées avec insistance reste un problème de santé générale, même s’il existe un vaccin2 disponible et de nombreux médicaments antiviraux sont en cours de développement. Le traitement standard de l’infection par le VHB comprend les analogues ifN-MD, nucléoside et nucléotide. Ces agents ont une activité antivirale directe et des capacités modulatrices immunitaires. Néanmoins, la séroconversion de l’antigène HBe (Ag)– porteurs avec anticorps anti-HBe (Ab) et la perte de sérum HBV acide désoxyribonucléique (ADN) apparaissent individuellement dans environ 20% des patients traités, et le contrôle immunologique entier du virus par la privation de la HBsAg n’est pas plus de 5%3. En outre, la réponse au traitement n’est souvent pas durable. La vaccination prophylactique avec les HBs Recombinants Ag est très efficace dans la prévention de l’infection, mais la vaccination thérapeutique HBs Ag n’est pas efficace. De toute évidence, les réponses immunitaires à médiation cellulaire T jouent un rôle essentiel dans le contrôle de l’infection par le VHB et de l’altération du foie; cependant, dans les patients chroniques d’hépatite, les cellules T HBV-réactives sont souvent supprimées, dysfonctionnelles, ou convertissentépuisé4,5,6. Par conséquent, chez les personnes atteintes d’une infection persistante au VHB, aucune tentative de rétablir l’immunité spécifique au VHB (c.-à-d. l’immunité à base de lymphocytes T) au moyen d’un remède antiviral, de cytokines immunomodulateurs ou d’immunisation curative n’a été efficace.
Le transfert de cellules adoptives (ACT) des lymphocytes T HBV Ag-spécifiques est un traitement efficace visant à éradiquer éventuellement les hépatocytes restants wih HBV7,8. L’ACT des CTL HBV-spécifiques dans les souris HBV-infectées a été montrée pour causer l’hépatite transitoire et douce, et une baisse dramatique des transcriptions d’acide ribonucléique de HBV (ARN) dans des hépatocytes. Dans ces études, les CTL n’ont pas inhibé la transcription des gènes du VHB, mais ont amélioré la dégradation des transcriptions du VHB9. Les CTL spécifiques au VHB sont importants pour prévenir l’infection virale et pour établir une médiation dans le déminage du VHB10,11. Pour les remèdes à base d’ACT, l’expansion in vitro des lymphocytes T spécifiques au VHB avec une forte réactivité pour la réinstallation in vivo a été suggérée comme une méthode idéale12,13,14; néanmoins, les approches actuelles sont limitées en ce qui concerne leurs capacités à générer, séparer et cultiver des quantités et des qualités appropriées de lymphocytes T spécifiques au VHB des patients pour les thérapies potentielles.
Bien que les essais cliniques présentent l’innocuité, la praticabilité et l’activité thérapeutique prospective des traitements à base de cellules au moyen de lymphocytes T conçus qui sont spécifiques aux hépatocytes infectés par le virus Du VHB, on s’inquiète des effets défavorables. se produisant des réponses autoimmunes en raison de la réactivité croisée du récepteur de cellule T de mauvais désespoir (TCR)15,16, reconnaissance hors cible d’Ag par TCR17 non spécifique et sur-cible hors-toxicité par un récepteur chimérique d’Ag (CAR) 18 ans, états-unis qui , 19 avec des tissus sains. Actuellement, les lymphocytes T génétiquement modifiés, qui n’ont qu’une persistance in vivo à court terme, sont généralement des lymphocytes T intermédiaires ou plus tard effecteurs. À ce jour, les cellules souches pluripotentes (CSP) sont la seule source disponible pour générer un grand nombre de cellules T naïves de type uniqueAg-spécifique 20,21,22,23. Les CSP induits (iPSC) sont simplement convertis à partir des cellules somatiques d’un patient grâce à l’utilisation de la transduction génique de plusieurs facteurs de transcription. En conséquence, les iPSC ont des caractéristiques similaires à celles des cellules souches embryonnaires (ESC)24. En raison de la flexibilité et de la possibilité pour la capacité infinie de se renouveler, en plus du remplacement de tissu, les traitements iPSC-basés peuvent être largement appliqués dans la médecine régénérative. En outre, les régiments sous-jacents iPSCs peuvent considérablement améliorer les thérapies cellulaires actuelles.
L’objectif global de cette méthode est de générer une grande quantité de CTL spécifiques au VHB à partir d’iPSC (c.-à-d. iPSC-CTL) pour l’immunothérapie à base d’ACT. Les avantages par rapport aux techniques alternatives sont que les iPSC-CTL spécifiques au VHB ont un tCR de type unique et un phénotype naïf, ce qui entraîne un développement plus de cellules T de mémoire après l’ACT. Il est démontré que l’ACT des iPSC-CTL spécifiques au VHB augmente la migration des cellules Fonctionnelles CD8et T dans le foie et réduit la réplication du VHB dans le foie et le sang des souris administrées. Cette méthode révèle une utilisation potentielle de l’iPSC-CTL virale spécifique à l’Ag pour l’immunothérapie du VHB et peut être adaptée pour générer d’autres cellules virales spécifiques à l’iPSC-T pour l’immunothérapie virale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente une méthode pour générer les iPSC-CTL virales spécifiques à ag pour une utilisation comme ACT pour supprimer la réplication du VHB dans un modèle de murine. Dans l’infection chronique de HBV, le génome viral forme un mini chromosome stable, l’ADN circulaire covalently fermé (cccDNA) qui peut persister tout au long de la durée de vie de l’hépatocyte. Cibler le dégagement du mini chromosome viral peut entraîner un traitement de l’infection chronique par le VHB. Le traitement antiviral ac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Adam J Gehring, de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, d’avoir fourni de l’ADNC pour les HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) – gènes hybrides hybrides à la murine humaine à restriction A2, et le Dr Pei-Jer Chen de la National Taiwan University pour avoir fourni des gènes tCR hybrides à murine humain restreints par A2, et le Dr Pei-Jer Chen de la National Taiwan University pour avoir fourni des gènes tCR hybrides à murine humain restreints a2, et le Dr Pei-Jer Chen de la National Taiwan University pour avoir fourni pAAV/HBV 1.2 construction. Ce travail est soutenu par le National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 et R21AI109239 à J. S.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
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