גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים
Summary
הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.
Abstract
הדלקת צהבת B וירוס (HBV) היא בעיה בריאותית גלובלית. עם מעל 350,000,000 אנשים מושפעים ברחבי העולם, זיהום HBV נשאר הגורם המוביל של סרטן הכבד. זוהי דאגה גדולה, במיוחד במדינות מתפתחות. כישלון של מערכת החיסון לטעון תגובה יעילה נגד HBV מוביל לזיהום כרוני. למרות חיסון HBV נוכח ותרופות אנטי ויראליות הרומן נוצרות, מיגור של תאים מאגר הווירוסים נשאר נושא בריאות מרכזי. מתוארים כאן היא שיטה עבור הדור של אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי CD8+ ציטוטוקסיים T לימפוציטים (ctls) נגזר בתאי גזע המושרה pluripotent (iPSCs) (כלומר, ipsc-ctls), אשר יש את היכולת לדכא את שכפול hbv. שכפול HBV הוא המושרה ביעילות בעכברים באמצעות הזרקה הידרודינמית של ביטוי HBV ביטויים, pAAV/HBV 1.2, לתוך הכבד. לאחר מכן, HBV לפני השטח של העכבר הספציפי Ag-iPSC-CTLs הועברו באופן מאמצים, אשר מדכא במידה ניכרת שכפול HBV בכבד ודם, כמו גם מונע ביטוי השטח HBV Ag החרופציטים. שיטה זו מדגימה שכפול HBV בעכברים לאחר הזרקת הידרודינמית והגזע הנגזר של תאים מבוססי Ag האנטי-ויראלי מאפשר לדכא שכפול HBV. פרוטוקול זה מספק שיטה שימושית לטיפול חיסוני HBV.
Introduction
בעקבות זיהום אקוטי, מערכת החיסון האדפטיבית (כלומר, חסינות מוסרית ותאית) שולטת בכמויות הכבד הקשורות ל-HBV. עדיין, מספר אנשים באזורים HBV-אנדמיים לא יכולים לחסל את וירוסים ולאחר מכן להמיר כאנשים כרוניים. יותר מ -25% של חולים כרוניים (> 250 מיליון אנשים) ברחבי העולם לפתח מחלת כבד מתקדמת, וכתוצאה מכך שחמת הכבד ו/או קרצינומה hepatocellular (HCC)1. כתוצאה מכך, מיגור של תאים נגועים בעקשנות נשאר בעיה כללית הבריאות, אף על פי שיש חיסון זמין2 ותרופות אנטי ויראליות רבים נמצאים בשלבי פיתוח. טיפול סטנדרטי עבור זיהום HBV כולל IFN-α, נוקלאוטיד, ונוקלאוטידים אנגיים. לסוכנים אלה יש פעילות אנטי-ויראלית. ישירה ומודולקקים חיסוניים עם זאת, המרה של אנטיגן HBe (Ag)+ מנשאים עם נוגדן נגד Hbe (Ab) ואובדן של סרום hbe deoxyribonucleic חומצה (DNA) להופיע בנפרד כ 20% של חולים מטופלים, ואת כל השליטה החיסונית של הנגיף אומת על ידי מניעת HBsAg הוא לא יותר 5%3. יתר על כן, התגובה לטיפול הוא לעתים קרובות לא עמיד. חיסון נגד רקומביננטי HBs Ag הוא יעיל מאוד במניעת זיהום, אבל החיסון HBs Ag טיפולית אינה יעילה. ברור, תא T בתיווך התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי בשליטה הזיהום HBV ליקוי בכבד; עם זאת, בחולים כרוניים צהבת, hbv-מגיבים תאים T נמחקים לעתים קרובות, לקוי, או להמיר4,5,6. כתוצאה מכך, אצל אנשים עם זיהום HBV מתמשך, אין ניסיונות לשחזר את החסינות הספציפית HBV (כלומר, החסינות המבוססת על תא T) באמצעות תרופה אנטי ויראלית, ציטוקינים מאפקקים, או חיסון מרפא השיגו הצלחה.
העברת תא המאמצת (פעולה) של תאים T ספציפיים של hbv Ag הוא טיפול יעיל בבימויו של בסופו של דבר לבער את הנותרים hepatocytes wih7,8. פעולה של hbv-ctls ספציפי לתוך העכברים הנגועים hbv הוכח לגרום ארעי, הפטיטיס מתון, וירידה דרמטית של חומצה hbv ריבונוקלאית (RNA) התעתיקים ב hepatocytes. במחקרים אלה, CTLs לא לעכב את שעתוק הגנים HBV אבל הגדילו את השפלה של התעתיקים HBV9. ה-CTLs הספציפי של HBV חשוב למנוע זיהום נגיפי ולתווך את הסיווג של HBV10,11. עבור תרופות מבוססות מעשה, בהרחבת מבחנה של תאים T הספציפי hbv עם פעילות מחודשת גבוהה עבור vivo החדש הוצע להיות שיטה אידיאלית12,13,14; אף על פי כן, הגישות הקיימות מוגבלות לגבי יכולותיהם להפקת, להפריד ולגדול כמויות ואיכויות המתאימות של תאים T HBV ספציפיים מחולים עבור טיפולים פוטנציאליים.
למרות ניסויים קליניים הנוכחי בטיחות, יכולת מעשית, ופעילות טיפולית פוטנציאליים של טיפולים מבוססי תאים באמצעות תאי T מהונדסים הינם ספציפיים HBV וירוס נגוע הנגיף, יש דאגות על ההשפעות שלילי המתרחשים מתוך תגובות אוטואימוניות בגלל החוצה פעילות מניעת קולטן תא T (tcr)15,16, off-היעד הכרה Ag ידי לא ספציפי tcr17 ו על-היעד off-רעילות על-ידי קולטן Ag אריק (רכב) מיכל בן 18 , 19 עם רקמות בריאות. כיום, תאי T ששונו גנטית, אשר יש רק התמדה לטווח קצר ב vivo, הם בדרך כלל ביניים או מאוחר יותר בתאי T. עד כה, בתאי גזע פלוריפוטנטי (PSCs) הם המקור היחיד הזמין להפקת מספרים גבוהים של תאי T חד-מסוגים בעלי סוג מסוים של ליחיד,20,21,22,23. המושרה PSCs (iPSCs) הם פשוט מומרים מתוך התאים הסומטיים של המטופל באמצעות שימוש התמרה גנטית של מספר גורמים שעתוק. כתוצאה מכך, iPSCs יש מאפיינים דומים כמו אלה של תאי גזע עובריים (ESCs)24. בשל הגמישות והאפשרות ליכולת אינסופית לחדש את העצמי, בנוסף להחלפת רקמות, טיפולים מבוססי iPSC עשוי להיות נרחב להחיל רפואה רגנרטיבית. יתר על כן, הגדודים הבסיסיים iPSCs עשויים לשפר באופן משמעותי את הטיפולים הנוכחיים התא.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפיק כמות גדולה של CTLs ספציפיים ל-HBV מiPSCs (כלומר, iPSC-CTLs) עבור טיפול חיסוני מבוסס-ACT. היתרונות על טכניקות חלופיות הן ש-iPSC-CTLs ספציפי ל-HBV יש מסוג TCR ופנוטיפים תמימים, שתוצאתו היא פיתוח תאים יותר של זיכרון לאחר הפעולה. הוא הוכיח כי ACT של iPSC ספציפי HBV-CTLs מגביר את הגירה של תאים CD8+ T פונקציונלי בכבד ומפחית את שכפול hbv הן בכבד והן בדם של עכברים מנוהלים. שיטה זו מגלה שימוש פוטנציאלי של אנטי ויראלי iPSC-CTLs הספציפי עבור טיפול חיסוני HBV ניתן להתאים כדי ליצור ויראלי אחרים הספציפי Ag-T תאים לטיפול חיסוני נגיפי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה להפקת ה-iPSC-CTLs הנגיפי הספציפי לשימוש ב-ACT כדי לדכא שכפול HBV במודל מורין. בזיהום HBV כרונית, הגנום הנגיפי צורות כרומוזום מיני יציבה, ה-DNA סגור מעגלי מעגלית (cccDNA) זה יכול להימשך לאורך כל תוחלת החיים של hepatocyte. פילוח הסיווג של כרומוזום מיני נגיפי עלול לגרום לתרופה של זיהום HBV כרו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ד ר אדם J Gehring מבית החולים הכללי של טורונטו המכון למתן cDNA עבור HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-הספציפי A2-מוגבל אנושי היברידית TCR, וד ר. פיי-ג’ר צ’ן מאוניברסיטת טייוואן הלאומית למתן המבנה של pAAV/HBV 1.2. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק בריאות R01AI121180, R01CA221867 ו R21AI109239 לג. ס. י.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Riferimenti
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Ricerca sul cancro. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
