स्टेम सेल व्युत्पन्न वायरल एजी-विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स चूहे में एचबीवी प्रतिकृति को दबा
Summary
यहाँ प्रस्तुत स्टेम सेल व्युत्पन्न वायरल प्रतिजन (एजी) विशेष टी लिम्फोसाइटों के दत्तक कोशिका हस्तांतरण (ACT) का उपयोग करके चूहों में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) प्रतिकृति के प्रभावी दमन के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस प्रक्रिया को एचबीवी संक्रमण के संभावित अधिनियम-आधारित इम्यूनोथेरेपी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण एक वैश्विक स्वास्थ्य मुद्दा है। दुनिया भर में 350 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करने के साथ, एचबीवी संक्रमण यकृत कैंसर का प्रमुख कारण बना हुआ है। यह विशेष रूप से विकासशील देशों में एक प्रमुख चिंता का विषय है। एचबीवी के खिलाफ एक प्रभावी प्रतिक्रिया माउंट करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की विफलता पुरानी संक्रमण की ओर जाता है। यद्यपि एचबीवी टीका मौजूद है और नवीन एंटीवायरल दवाएं बनाई जा रही हैं, फिर भी वायरस-आरक्षण कोशिकाओं का उन्मूलन एक प्रमुख स्वास्थ्य विषय बना हुआ है। यहाँ वर्णित वायरल प्रतिजन (एजी) की पीढ़ी के लिए एक विधि है -विशिष्ट CD8+ cytotoxic टी लिम्फोसाइटों (CTLs) प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) (यानी, iPSC-CTLs) से व्युत्पन्न, जो एचबीवी प्रतिकृति को दबाने की क्षमता है. एचबीवी प्रतिकृति कुशलतापूर्वक जिगर में एक एचबीवी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, पावएवी/एचबीवी1.2 के हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन के माध्यम से चूहों में प्रेरित किया जाता है। फिर, एचबीवी सतह एजी-विशिष्ट माउस आईपीएससी-सीटीएल को दत्तक रूप से स्थानांतरित किया जाता है, जो यकृत और रक्त में एचबीवी प्रतिकृति को बहुत दबाता है और साथ ही हेप्टोसाइट्स में एचबीवी सतह एजी अभिव्यक्ति को रोकता है। यह विधि हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन के बाद चूहों में एचबीवी प्रतिकृति को प्रदर्शित करती है और स्टेम सेल व्युत्पन्न वायरल एजी-विशिष्ट CTLs एचबीवी प्रतिकृति को रोक सकते हैं। यह प्रोटोकॉल एचबीवी इम्यूनोथेरेपी के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है।
Introduction
तीव्र संक्रमण के बाद, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली (यानी, हास्य और सेलुलर प्रतिरक्षा) तीव्र एचबीवी से संबंधित हेपेटाइटिस के थोक को नियंत्रित करती है। फिर भी, एचबीवी-एंटोइनल क्षेत्रों में कई लोग वायरस को खत्म नहीं कर सकते हैं और बाद में पुराने व्यक्तियों के रूप में परिवर्तित नहीं कर सकते हैं। दुनिया भर में 25% से अधिक पुराने रोगियों (gt; 250 मिलियन लोग) प्रगतिशील यकृत रोग विकसित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप लीवर सिरोसिस और/या हेपेटोकोशिकीय कार्सिनोमा (एचसीसी)1होता है। नतीजतन, आग्रहपूर्ण रूप से संक्रमित कोशिकाओं का उन्मूलन एक सामान्य स्वास्थ्य समस्या बनी हुई है, भले ही वहाँ एक उपलब्ध टीका2 और कई एंटीवायरल दवाएं विकास के अधीन हैं। एचबीवी संक्रमण के लिए मानक उपचार में आईएफएन-जेड, न्यूक्लिओसाइड और न्यूक्लिओटाइड एनालॉग शामिल हैं। इन एजेंटों प्रत्यक्ष एंटीवायरल गतिविधि और प्रतिरक्षा आमध्यस्थ क्षमता है. फिर भी, एचबी एंटीजन (एजी)+ विरोधी एचबीएंटी (एबी) के साथ वाहक और सीरम एचबीवी deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) की हानि इलाज रोगियों के लगभग 20% में व्यक्तिगत रूप से दिखाई देते हैं, और वायरस के पूरे प्रतिरक्षा नियंत्रण HBsAg के अभाव से सत्यापित 5%3से अधिक नहीं है . इसके अलावा, उपचार के लिए प्रतिक्रिया अक्सर टिकाऊ नहीं है. रिकॉमबिनेंट HBs एजी के साथ रोगनिरोधी टीकाकरण संक्रमण को रोकने में अत्यधिक प्रभावी है, लेकिन चिकित्सीय HBs एजी टीकाकरण प्रभावी नहीं है। जाहिर है, टी सेल मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं एचबीवी संक्रमण और जिगर हानि को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; हालांकि, क्रोनिक हेपेटाइटिस रोगियों में, एचबीवी-रिएक्टिव टी कोशिकाओं को अक्सर नष्ट कर दिया जाता है, बेकार, या समाप्त4,5,6 परिवर्तित कर दिया जाताहै। नतीजतन, लगातार एचबीवी संक्रमण वाले व्यक्तियों में, एंटी-वायरल उपचार, इम्यूनो-मॉडुलन साइटोकिन्स, या उपचारात्मक प्रतिरक्षण के माध्यम से एचबीवी-विशिष्ट प्रतिरक्षा (यानी, टी सेल-आधारित प्रतिरक्षा) को बहाल करने का कोई प्रयास नहीं है।
एचबीवी एजी-विशिष्ट टी कोशिकाओं के दत्तक कोशिका स्थानांतरण (ACT) एक कुशल उपचार अंततः शेष hepatocytes wih HBV7,8उन्मूलन करने के लिए निर्देशित है। एचबीवी-संक्रमित चूहों में एचबीवी-विशिष्ट सीटीएल के अधिनियम को क्षणिक, हल्के हेपेटाइटिस, और हेपाटोसाइट्स में एचबीवी राइबोनुक्लिइक एसिड (आरएनए) ट्रांसक्रिप्ट्स में नाटकीय गिरावट का कारण दिखाया गया है। इन अध्ययनों में, सीटीएल ने एचबीवी जीनों के प्रतिलेखन को बाधित नहीं किया बल्कि एचबीवी लिपियों9की गिरावट को बढ़ाया। वायरल संक्रमण को रोकने और एचबीवी10,11की निकासी में मध्यस्थता करने के लिए एचबीवी-विशिष्ट सीटीएल महत्वपूर्ण हैं। अधिनियम-आधारित उपचारों के लिए, विवो पुनर्वास में उच्च अभिक्रियाशीलता वाले एचबीवी-विशिष्ट टी कोशिकाओं के विट्रो विस्तार में एक आदर्श विधि12,13,14होने का सुझाव दिया गया है; फिर भी, वर्तमान दृष्टिकोण उत्पन्न करने के लिए अपनी क्षमताओं के बारे में प्रतिबंधित कर रहे हैं, अलग, और संभावित चिकित्सा के लिए रोगियों से एचबीवी-विशिष्ट टी कोशिकाओं के उचित मात्रा और गुणों को विकसित.
हालांकि नैदानिक परीक्षण वर्तमान सुरक्षा, व्यावहारिकता, और इंजीनियर टी कोशिकाओं है कि एचबीवी वायरस संक्रमित hepatocytes के लिए विशिष्ट हैं के माध्यम से सेल आधारित उपचार के संभावित चिकित्सीय गतिविधि, वहाँ प्रतिकूल प्रभाव के बारे में चिंता कर रहे हैं mispairing टी सेल रिसेप्टर से पार प्रतिक्रिया की वजह से autoimmune प्रतिक्रियाओं से होने वाली (TCR)15,16,गैर-विशिष्ट TCR द्वारा बंद लक्ष्य एजी मान्यता17 और पर लक्ष्य बंद विषाक्तता द्वारा एक झंकार एजी रिसेप्टर (सीएआर) 18 , 19 स्वस्थ ऊतकों के साथ. वर्तमान में, आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं, जो केवल विवो में अल्पकालिक हठ है, आमतौर पर मध्यवर्ती या बाद में प्रभावक टी कोशिकाओं रहे हैं. तारीख करने के लिए, pluripotent स्टेम सेल (PSCs) केवल भोले एकल प्रकार एजी विशिष्ट टी कोशिकाओं20,21,22,23की उच्च संख्या उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध स्रोत हैं. प्रेरित पीएससी (iPSCs) बस कई प्रतिलेखन कारकों के जीन transduction के उपयोग के माध्यम से एक रोगी की दैहिक कोशिकाओं से बदल रहे हैं. परिणामस्वरूप, आई पी एस सी की लक्षणात् वरीय लक्षणे भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) 24 के समान होतीहैं। लचीलापन और स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए अनंत क्षमता के लिए संभावना के कारण, ऊतक प्रतिस्थापन के अलावा, iPSC आधारित उपचार व्यापक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा में लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, iPSCs अंतर्निहित रेजिमेंटों काफी वर्तमान सेल आधारित उपचार में सुधार हो सकता है.
इस विधि का समग्र लक्ष्य ACT-आधारित इम्यूनोथेरेपी के लिए आईपीएससी (यानी, आईपीएससी-सीटीएल) से एचबीवी-विशिष्ट सीटीएल की एक बड़ी राशि उत्पन्न करना है। वैकल्पिक तकनीकों पर लाभ यह है कि एचबीवी-विशिष्ट iPSC-CTLs एक एकल प्रकार TCR और भोले phenotype है, जो अधिनियम के बाद और अधिक स्मृति टी सेल विकास में परिणाम है. यह दिखा दिया है कि एचबीवी-विशिष्ट iPSC-CTLs के अधिनियम जिगर में कार्यात्मक CD8+ टी कोशिकाओं के प्रवास बढ़ जाती है और दोनों जिगर और प्रशासित चूहों के रक्त में एचबीवी प्रतिकृति कम कर देता है। इस विधि से एचबीवी इम्यूनोथेरेपी के लिए वायरल एजी-विशिष्ट आईपीएससी-सीटीएल के संभावित उपयोग का पता चलता है और वायरल इम्यूनोथेरेपी के लिए अन्य वायरल एजी-विशिष्ट आईपीएससी-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक murine मॉडल में HBV प्रतिकृति को रोकें ACT के रूप में उपयोग के लिए वायरल Ag-विशिष्ट iPSC-CTLs जनरेट करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। पुरानी एचबीवी संक्रमण में, वायरल जीनोम एक स्थिर मिनी गुणसूत्र बन…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) के लिए cDNA प्रदान करने के लिए टोरंटो जनरल अस्पताल अनुसंधान संस्थान से डॉ एडम जे Gehring धन्यवाद – विशिष्ट A2-प्रतिबंधित मानव-मौर संकर TCR जीन, और डॉ Pei-जेर चेन राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय से प्रदान करने के लिए pAAV/HBV 1.2 निर्माण. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01AI121180, R01CA2221867 और R21AI109239 जे एस के लिए समर्थित है
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
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