Стволовые клетки- производные вирусные Ag-специфические T Лимфоциты подавить HBV репликации у мышей
Summary
Представлен протокол для эффективного подавления вируса гепатита В (HBV) репликации у мышей с помощью приемной передачи клеток (ACT) стволовых клеток полученных вирусных антигенов (Ag)-специфических Т-лимфоцитов. Эта процедура может быть адаптирована для потенциальной аСТ на основе иммунотерапии HBV инфекции.
Abstract
Инфекция, связанная с вирусом гепатита В (HBV), является глобальной проблемой здравоохранения. С более чем 350 миллионов людей, пострадавших во всем мире, HBV инфекции остается ведущей причиной рака печени. Это вызывает серьезную озабоченность, особенно в развивающихся странах. Неспособность иммунной системы смонтировать эффективный ответ против HBV приводит к хронической инфекции. Хотя вакцина против ог. ВГВ присутствует и создаются новые противовирусные препараты, искоренение вирусно-резервуарных клеток остается одной из основных тем для здоровья. Описано здесь метод для генерации вирусного антигена (Ag) -специфические CD8и цитотоксические Т-лимфоциты (CtL), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) (т.е. iPSC-CTL), которые имеют возможность подавлять репликацию HBV. Репликация HBV эффективно индуцируется у мышей через гидродинамический инъекций плазмиды экспрессии HBV, pAAV/HBV1.2, в печень. Затем, HBV поверхности Ag-специфической мыши iPSC-CTLs являются приемно переданы, что значительно подавляет репликации HBV в печени и крови, а также предотвращает HBV поверхности Ag выражение в гепатоцитов. Этот метод демонстрирует репликацию HBV у мышей после гидродинамических инъекций и что стволовые клетки, полученные вирусных Ag-специфических CTL может подавить репликацию HBV. Этот протокол предоставляет полезный метод иммунотерапии HBV.
Introduction
После острой инфекции адаптивная иммунная система (т.е. гуморальный и клеточный иммунитет) контролирует основную часть острого гепатита, связанного с ВГВ. Тем не менее, ряд людей в Эндемичных регионах HBV не могут устранить вирусы и впоследствии преобразовать в качестве хронических лиц. Более 25% хронических пациентов (250 миллионов человек) во всем мире развивают прогрессирующее заболевание печени, в результате чего цирроз печени и/или гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1. В результате искоренение настойчивых инфицированных клеток остается общей проблемой здоровья, несмотря на то, что имеется вакцина2 и в настоящее время разрабатывается множество противовирусных препаратов. Стандартное лечение HBV-инфекции включает в себя аналоги ИФН-З, нуклеозида и нуклеотида. Эти агенты обладают непосредственной противовирусной активностью и иммуномодулирующими способностями. Тем не менее, сероконверсия HBe антигена (Ag)– носители антител (Ab) и потеря сывороточной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) появляются индивидуально примерно у 20% пациентов, а также весь иммунологический контроль вируса проверено лишением HBsAg составляет не более 5%3. Кроме того, реакция на лечение часто не является прочной. Профилактическая вакцинация с помощью рекомбинантных HBs Ag очень эффективна в профилактике инфекции, но терапевтическая вакцинация HBs Ag неэффективна. Очевидно, что При опосредованный Т-клеточными иммунными реакциями играет решающую роль в борьбе с инфекцией ВГВ и нарушением функции печени; однако, в хронических больных гепатитом, HBV-реактивные Т-клетки часто удаляются, дисфункциональные, или конвертировать исчерпаны4,5,6. Следовательно, у людей с постоянной инфекцией ВГВ не удалось ни одного попытки восстановить иммунитет, специфический вХВ (т.е. Т-клеточный иммунитет) с помощью противовирусного средства, иммуномодулирующих цитокинов или лечебной иммунизации.
Приемная передача клеток (ACT) HBV Ag-специфических Т-клеток является эффективным лечением, направленным на то, чтобы в конечном итоге искоренить оставшиеся гепатоциты wih HBV7,8. ACT HBV-специфических CTLs в HBV-инфицированных мышей было показано, что причиной переходного, легкого гепатита, и резкое падение ВГВ рибонуклеиновой кислоты (РНК) стенограммы в гепатоцитов. В этих исследованиях, CTLs не ингибировать транскрипцию генов HBV но усилил деградацию транскриптов HBV9. HBV-специфических CTL важны для предотвращения вирусной инфекции и посредничать в очистке HBV10,11. Для ACT основе средств правовой защиты, in vitro расширение HBV-специфических Т-клеток с высокой реактивностью для переселения in vivo было предложено быть идеальным методом12,13,14; тем не менее, нынешние подходы ограничены в отношении их способности генерировать, отделять и расти соответствующие количества и качества HBV-специфических Т-клеток от пациентов для потенциальных методов лечения.
Хотя клинические испытания представляют безопасность, осуществимость и перспективную терапевтическую активность клеточного лечения с помощью инженерных Т-клеток, которые специфичны для Инфицированных вирусом ВпГ гепатоцитов, есть опасения по поводу неблагоприятных последствий происходящих из аутоиммунных реакций из-за перекрестной реактивности от неправильного T-клеточного рецептора (TCR)15,16, вне целевого распознавания Ag неспецифическим TCR17 и на цель вне токсичности химерных рецепторов Ag (CAR) 18 лет , 19 со здоровыми тканями. В настоящее время генетически модифицированные Т-клетки, которые имеют только краткосрочную стойкость in vivo, обычно являются промежуточными или более поздними Т-клетками. На сегодняшний день, плюрипотентные стволовые клетки (PSCs) являются единственным источником для создания большого количества наивных однотипных Ag-специфических Т-клеток20,21,22,23. Индуцированные ПЦ (iPSCs) просто преобразуются из соматических клеток пациента с помощью трансдукции генов нескольких транскрипционных факторов. В результате, iPSCs имеют те же характеристики, как у эмбриональных стволовых клеток (ESCs)24. Благодаря гибкости и возможности для бесконечной способности к самообновлению, в дополнение к замене тканей, iPSC основе лечения могут быть широко применены в регенеративной медицине. Кроме того, полки, лежащие в основе iPSCs, могут существенно улучшить текущую клеточную терапию.
Общая цель этого метода заключается в генерации большого количества HBV-специфических CtLs из iPSCs (т.е. iPSC-CTLs) для иммунотерапии на основе АКТ. Преимущества по сравнению с альтернативными методами в том, что HBV-специфические iPSC-CTL имеют однотипный TCR и наивный фенотип, что приводит к большему развитию Т-клеток памяти после ACT. Показано, что ACT HBV-специфических iPSC-CTLs увеличивает миграцию функциональных CD8и Т-клеток в печени и уменьшает репликацию HBV как в печени, так и в крови управляемых мышей. Этот метод показывает потенциальное использование вирусных Ag-специфических iPSC-CTL для иммунотерапии HBV и может быть адаптирован для генерации других вирусных Ag-специфических iPSC-T-клеток для вирусной иммунотерапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой метод для создания вирусных Ag-специфических iPSC-CTLs для использования в качестве ACT для подавления репликации HBV в модели murine. При хронической инфекции HBV вирусный геном образует стабильную мини-хромосому, ковалентно закрытую круговую ДНК (cccDNA), которая мо…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-ра Адама J Геринга из Торонто больницы научно-исследовательский институт для предоставления cDNA для HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) – конкретные A2-ограниченный человек-мурин гибридных генов TCR, и д-р Пей-Джер Чен из Национального университета Тайваня для обеспечения конструкция pAAV/HBV 1.2. Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения Грант R01AI121180, R01CA221867 и R21AI109239 до J. S.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Riferimenti
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Ricerca sul cancro. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
