Induire la méningite méningococcique Sérogroupe C chez les souris par l'intermédiaire de la livraison intracisternal
Summary
Ici, nous décrivons une méthode pour induire la méningite méningococcique par une voie intracisternal d’infection chez les souris adultes. Nous présentons un protocole étape par étape de l’infection méningococcique de la préparation de l’inoculum à l’infection intracisternal ; enregistrez ensuite la survie animale et évaluez les charges bactériennes dans les tissus murines.
Abstract
Neisseria meningitidis (méningocoque) est un micro-organisme à portée étroite, mondialement reconnu comme la principale cause de méningite bactérienne. Le méningocoque est un colonisateur transitoire du nasopharynx humain d’environ 10% de sujet sain. Dans des circonstances particulières, il acquiert une capacité invasive de pénétrer la barrière muqueuse et envahit la circulation sanguine causant la septicémie. Dans le dernier cas, la septicémie fulminante pourrait survenir même sans le développement conséquent de la méningite. Inversement, les bactéries pourraient mal se multiplier dans la circulation sanguine, traverser la barrière hémato-encéphalique, atteindre le système nerveux central, conduisant à une méningite fulminante. Les modèles murins de la méningite bactérienne représentent un outil utile pour étudier les interactions hôte-pathogène et pour analyser les mécanismes pathogétiques responsables de cette maladie mortelle. Bien que plusieurs systèmes modèles expérimentaux aient été évalués au cours des dernières décennies, aucun d’entre eux n’a été en mesure de reproduire les événements pathologiques caractéristiques de la méningococcie. Dans ce protocole expérimental, nous décrivons une procédure détaillée pour l’induction de la méningite méningococcique dans un modèle de souris basé sur l’inoculation intracisternal des bactéries. Les signes particuliers de la méningite humaine ont été enregistrés dans l’hôte murine par l’évaluation des paramètres cliniques (par exemple, température, poids corporel), évaluation du taux de survie, analyse microbiologique et examen histologique des lésions cérébrales. Lors de l’utilisation de l’inoculum intracisternal (i.cist.), les méningocoques complètent la livraison directement dans la cisternamagna, conduisant à une réplication méningococcique très efficace dans le tissu cérébral. Une augmentation de 1 000 fois du nombre viable de bactéries est observée dans environ 18 h. En outre, les méningocoques sont également trouvés dans la rate, et le foie des souris infectées, suggérant que le foie peut représenter un organe cible pour la réplication du méningocoque.
Introduction
Neisseria meningitidis est un Gram négatif – proteobacterium limité à l’hôte humain, bien connu pour être l’une des causes les plus courantes de méningite et de septicémie dans la population humaine à travers le monde. Il colonise les voies respiratoires supérieures (nez et gorge) des porteurs sains et asymptomatiques (2-30% de la population), mais la bactérie échappe parfois à diverses défenses immunitaires de l’hôte et se propage de la circulation sanguine au cerveau provoquant un local incontrôlé l’inflammation, connue sous le nom de méningite à méningocoques. Une combinaison de facteurs d’hôte et de bactéries semble contribuer à la transition du comportement commensal au comportement invasif1.
N. meningitidis est spécialisé exclusivement dans la colonisation et l’infection humaines. Il a une gamme étroite d’hôte et, par conséquent, a des études in vivo limitées de pathogénie due à l’absence de modèles animaux appropriés qui reproduisent la maladie méningococcique humaine. En conséquence, il avait mené aux lacunes fondamentales dans la compréhension concernant la pathogénie de la septicémie et de la méningite provoquées par le méningocoque. Au cours des dernières décennies, le développement de nombreux systèmes in vitro a permis d’identifier plusieurs facteurs de virulence méningococciques2,3,4. Bien que ces études précieuses aient fourni des idées importantes pour comprendre le rôle de ces facteurs pour une infection à méningocoque réussie, ces modèles n’ont pas permis d’évaluer les conséquences des interactions bactériennes avec l’humour et le cellulaire système immunitaire et encore moins avec l’ensemble du tissu. Les modèles animaux in vivo d’infection sont également d’une grande pertinence pour l’évaluation du degré de protection conféré par les formulations de vaccins. En tant qu’agent pathogène humain-tropique, le méningocoque possède les déterminants appropriés nécessaires au succès de l’infection, comme les structures de surface (c.-à-d. les protéines de type IV pili et d’opacité) et l’utilisation du fer pour les récepteurs humains et les protéines de transport (c.-à-d. transferin et lactoferrine)5,6,7 pour bien adhérer, survivre et envahir l’hôte humain. Enfin, les capacités de variation génétique de l’agent pathogène pour échapper et/ou bloquer la réponse immunitaire humaine contribuent encore au tropisme élevé des espèces8,9. Par conséquent, l’absence de facteurs spécifiques de l’hôte, impliqués dans l’interaction, peut bloquer les étapes du cycle de vie de l’agent pathogène, établissant des difficultés importantes dans le développement de modèles de petits animaux résumant le cycle de vie méningococcique.
Au cours des dernières décennies, plusieurs approches ont été développées pour améliorer notre compréhension du cycle infectieux du méningocoque. Les infections de deux modèles animaux, la souris et le rat, soit intrapéritone (i.p.) ou intranasally (i.n.), ont été développées pour reproduire la méningococcie10,11,12,13,14 ,15,16,17. La souris de laboratoire est probablement l’un des animaux les plus polyvalents pour induire une infection à méningocoque expérimentale.
Cependant, le mode d’infection i.p. conduit au développement de la septicémie grave bien qu’il n’imite pas la voie naturelle de l’infection, tandis que la voie i.n. de l’infection a été utile pour évaluer la pathogénie méningococcique, même si elle peut induire l’infection pulmonaire avant la septicémie10,11,12,13,14,15,16,17.
Le modèle de souris i.p. a joué un rôle déterminant dans l’évaluation de la protection contre le défi du méningocoque10,11,12. Le modèle de souris de la colonisation méningococcique basé sur la voie i.n. de l’infection a été développé avec des souris infantiles, car elles sont plus sensibles aux méningocoques, pour reproduire une infection invasive imitant le cours de la maladie méningococcique chez l’homme 13,14,15,16,17. En outre, pour promouvoir la réplication du méningocoque dans l’hôte murine, un nombre croissant de stratégies techniques ont également été appliquées, y compris l’administration du fer aux animaux pour améliorer l’infection, l’utilisation d’inoculumbactérien élevé , souche bactérienne à passage de souris ainsi que l’emploi d’hôtes animaux infantiles ou immunocompromis10,13,15,18,19. L’expression de facteurs humains spécifiques comme CD4620 ou transferin21 a augmenté la susceptibilité des souris à cette bactérie humaine-tropique ; l’emploi du modèle humain de xénogreffe de peau de l’infection a également été utile pour évaluer la capacité d’adhérence des méningocoques à l’endothélium humain22,23. Collectivement, le développement récent de souris transgéniques humanisées a amélioré la compréhension de la pathogénie méningococcique et de ses interactions hôtes.
Auparavant, nous avons développé un modèle murin de méningite à méningocoques où l’inoculation des bactéries a été réalisée dans la magna de la citerne des souris adultes avec des bactéries à passage de souris24. Les paramètres cliniques et le taux de survie des souris infectées ont démontré l’établissement de la méningite avec des caractéristiques comparables à celles observées dans l’hôte humain, ainsi que les analyses microbiologiques et histologiques du cerveau. De ces souris infectées, les bactéries ont été, également, récupérées du sang, du foie, et de la rate, et des charges bactériennes des organes périphériques se sont corrélées avec la dose infectieuse. En particulier, ce modèle a été utilisé pour évaluer la virulence d’une souche mutante isogénique défectueuse dans le transporteur L-glutamate GltT24. Récemment, en utilisant notre modèle de souris de méningite à méningocoques à base de i.cist. route avec la souche de sérogroupe C 93/42862,24 et un mutant isogénique défectueux dans l’encodage de gène cssA pour UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, nous avons analysé le rôle de l’acide sialique exposé dans l’établissement de la maladie chez la souris.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour induire la méningite expérimentale de méningocoque basée sur l’i.cist. voie d’infection chez les souris adultes De Balb/c. Cette méthode est particulièrement utile pour la caractérisation de l’infection à méningocoque s’est alignée sur un hôte murine, ainsi que pour l’évaluation de la virulence entre les souches de référence de type sauvage et les mutants isogéniques. La voie intra-cisternale de l’infection assure la livraison complète des méningocoques directement dans la magna de cisterna, qui facilite à son tour la réplication bactérienne dans le fluide céphalo-rachidien (CSF) et induit la méningite avec des dispositifs qui imitent ceux présent chez l’homme2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous décrivons un protocole expérimental pour induire la méningite méningococcique chez les souris adultes par i.cist. l’inoculation des bactéries méningococciques. À notre connaissance, aucun autre modèle de méningite à méningocoque n’a été développé chez des souris de laboratoire infectées par i.cist. itinéraire; dans le passé, cette façon a été explorée pour fournir des modèles de méningite à méningocoques chez le rat31 et le lapin3…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les études ont été soutenues en partie par PRIN 2012 [numéro de subvention 2012WJSX8K]: “Host-microbe interaction models in mucosal infections: development of new therapeutic strategies” et par PRIN 2017 [2017SFBFER]: “Une approche intégrée pour lutter contre l’interaction entre les l’adaptation, les conditions stressantes et la résistance aux antimicrobiens des pathogènes difficiles ».
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Riferimenti
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 – Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
