Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal
Summary
Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningococo) es un microorganismo de rango estrecho, reconocido mundialmente como la principal causa de meningitis bacteriana. El meningococo es un colonizador transitorio de la nasofaringe humana de aproximadamente el 10% del sujeto sano. En circunstancias particulares, adquiere una capacidad invasiva para penetrar la barrera mucosa e invade el torrente sanguíneo causando septicemia. En el último caso, la sepsis fulminante podría surgir incluso sin el consiguiente desarrollo de la meningitis. Por el contrario, las bacterias podrían multiplicarse mal en el torrente sanguíneo, cruzar la barrera hematoencefálica, alcanzar el sistema nervioso central, lo que conduce a la meningitis fulminante. Los modelos murinos de meningitis bacteriana representan una herramienta útil para investigar las interacciones huésped-patógeno y analizar los mecanismos patogenéticos responsables de esta enfermedad letal. Aunque se han evaluado varios sistemas modelo experimentales en las últimas décadas, ninguno de ellos fue capaz de reproducir los eventos patológicos característicos de la enfermedad meningocócica. En este protocolo experimental, describimos un procedimiento detallado para la inducción de la meningitis meningocócica en un modelo de ratón basado en la inoculación intracisternal de bacterias. Los signos peculiares de la meningitis humana se registraron en el huésped murino mediante la evaluación de parámetros clínicos (por ejemplo, temperatura, peso corporal), evaluación de la tasa de supervivencia, análisis microbiológico y examen histológico de lesiones cerebrales. Cuando se utiliza inóculo intracisternal (i.cist.), meningococci entrega completa directamente en cisterna magna, lo que conduce a una replicación meningocócica muy eficiente en el tejido cerebral. Se observa un aumento de 1.000 veces por el recuento viable de bacterias en aproximadamente 18 h. Por otra parte, los meningococos también se encuentran en el bazo, y el hígado de ratones infectados, lo que sugiere que el hígado puede representar un órgano diana para la replicación meningocócica.
Introduction
Neisseria meningitidis es un Gram negativo-proteobacterium restringido al huésped humano, bien conocido por ser una de las causas más comunes de meningitis y sepsis en la población humana en todo el mundo. Coloniza el tracto respiratorio superior (nariz y garganta) de portadores sanos y asintomáticos (2-30% de la población), pero la bacteria a veces evade varias defensas inmunitarias del huésped y se propaga desde el torrente sanguíneo al cerebro causando un inflamación, conocida como meningitis meningocócica. Una combinación de factores huésped y bacterianos parece contribuir a la transición de la comensal al comportamiento invasivo1.
N. meningitidis está especializada exclusivamente en la colonización humana y la infección. Tiene un rango de huésped estrecho y, por lo tanto, tiene estudios de patogénesis in vivo limitadodebidodebido a la falta de modelos animales adecuados que reproduzcan la enfermedad meningocócica humana. Como resultado, había dado lugar a lagunas fundamentales en la comprensión relativa a la patogénesis de la septicemia y la meningitis causada por el meningococo. En las últimas décadas, el desarrollo de muchos sistemas in vitro permitió la identificación de varios factores de virulencia meningocócica2,3,4. Aunque estos valiosos estudios proporcionaron información importante para entender el papel de estos factores para una infección meningocócica exitosa, estos modelos no permitieron evaluar las consecuencias de las interacciones bacterianas con el humor y celular sistema inmunológico y aún menos con todo el tejido. Los modelos animales in vivo de infección son de gran importancia también para la evaluación del grado de protección conferido por las formulaciones de vacunas. Como patógeno humano-trópico, el meningococo posee determinantes apropiados necesarios para una infección exitosa, como estructuras superficiales (es decir, proteínas pili y de opacidad tipo IV) y sistemas de admisión de hierro para receptores humanos y proteínas de transporte (es decir, transferrina y lactoferrina)5,6,7 para adherirse adecuadamente, sobrevivir e invadir el huésped humano. Por último, las capacidades de variación genética del patógeno para evadir y/o bloquear la respuesta inmune humana contribuyen aún más al alto tropismo de especies8,9. Por lo tanto, la ausencia de factores de huésped específicos, involucrados en la interacción, puede bloquear los pasos del ciclo de vida del patógeno, estableciendo dificultades significativas en el desarrollo de pequeños modelos animales que resumen el ciclo de vida meningocócico.
En las últimas décadas, se han desarrollado varios enfoques para mejorar nuestra comprensión del ciclo infeccioso meningocócico. Las infecciones de dos modelos animales, ratón y rata, ya sea intraperitonealmente (i.p.) o intranasal (es decir), se desarrollaron para reproducir la enfermedad meningocócica10,11,12,13,14 ,15,16,17. El ratón de laboratorio es probablemente uno de los animales más versátiles para inducir una infección meningocócica experimental.
Sin embargo, la vía i.p. de infección conduce al desarrollo de sepsis grave, aunque no imita la vía natural de la infección, mientras que la vía i.n. de la infección fue útil para evaluar la patogénesis meningocócica, aunque puede inducir una infección pulmonar antes de la sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
El modelo de ratón i.p. fue fundamental para evaluar la protección contra el desafío meningocócico10,11,12. El modelo de ratón de colonización meningocócica basada en la vía i.n. de la infección se ha desarrollado con ratones lactantes, ya que son más susceptibles a los meningococos, para reproducir una infección invasiva imitando el curso de la enfermedad meningocócica en humanos 13,14,15,16,17. Además, para promover la replicación meningocócica en el huésped murino, también se aplicó un número creciente de estrategias técnicas, incluida la administración del hierro a los animales para mejorar la infección, el uso de inóculobacteriano alto, cepa bacteriana pasada por ratón, así como el empleo de huéspedes animales lactantes o inmunocomprometidos10,13,15,18,19. La expresión de factores humanos específicos como CD4620 o transferrina21 ha aumentado la susceptibilidad de los ratones a esta bacteria del trópico humano; el empleo del modelo de infección de xenoinjerto de piel humana también ha sido útil para evaluar la capacidad de adhesión de los meningococos al endotelio humano22,23. Colectivamente, el reciente desarrollo de ratones transgénicos humanizados ha mejorado la comprensión de la patogénesis meningocócica y sus interacciones de huésped.
Anteriormente, desarrollamos un modelo murino de meningitis meningocócica donde la inoculación de bacterias se realizaba en la cisterna magna de ratones adultos con bacterias pasajeras de ratón24. Los parámetros clínicos y la tasa de supervivencia de los ratones infectados demostraron el establecimiento de meningitis con características comparables a las que se ven en el huésped humano, así como los análisis microbiológicos e histológicos del cerebro. De estos ratones infectados, las bacterias también se recuperaron de la sangre, el hígado y el bazo, y las cargas bacterianas de los órganos periféricos correlacionados con la dosis infecciosa. En particular, este modelo se empleó para evaluar la virulencia de una cepa mutante isogénica defectuosa en el transportador L-glutamato GltT24. Recientemente, utilizando nuestro modelo de ratón de meningitis meningocócica basado en i.cist. ruta con cepa serogrupo C 93/42862,24 y un mutante isogénico defectuoso en codificación de genes cssA para UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa25, hemos analizado el papel del ácido siálico expuesto en el establecimiento enfermedad en ratones.
En este protocolo, describimos un método sencillo para inducir meningitis meningocócica experimental basada en el i.cist. vía de infección en ratones adultos Balb/c. Este método es particularmente útil para la caracterización de la infección meningocócica en un huésped murino, así como para la evaluación de la virulencia entre cepas de referencia de tipo silvestre y mutantes isogénicos. La vía intracisternal de la infección asegura la entrega completa de los meningococos directamente en la cisterna magna, lo que a su vez facilita la replicación bacteriana en el líquido cefalorraquídeo (LCR) e induce meningitis con características que imitan a las presente en humanos2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, describimos un protocolo experimental para inducir la meningitis meningocócica en ratones adultos por i.cist. inoculación de bacterias meningocócicas. Hasta nuestro conocimiento, no se ha desarrollado ningún otro modelo de meningitis meningocócica en ratones de laboratorio infectados por i.cist. ruta; en el pasado, esta forma ha sido explorada para proporcionar modelos de meningitis meningocócica tanto en rata31 como en conejo32. Es bien sabido que la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los estudios fueron apoyados en parte por PRIN 2012 [número de subvención 2012WJSX8K]: “Modelos de interacción Host-microbe en infecciones mucosas: desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas” y por PRIN 2017 [2017SFBFER]: “Un enfoque integrado para abordar la interacción entre condiciones estresantes y resistencia a los antimicrobianos de patógenos desafiantes”.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Riferimenti
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