İntrasisternal Doğum yoluyla Farelerde Meningokok Menenjit Serogroup C Indükleyen
Summary
Burada, erişkin farelerde intrasisternal enfeksiyon yolu ile meningokok menenjitini tetikleyen bir yöntem tanımlıyoruz. İnokül inosiyal enfeksiyona kadar meningokok enfeksiyonunun adım adım protokolünü sıyoruz; sonra hayvan hayatta kalma kaydetmek ve mindik dokularında bakteri yükleri değerlendirmek.
Abstract
Neisseria menenjiti (meningokok) bakteriyel menenjitin önde gelen nedeni olarak kabul edilen dar konaklı bir mikroorganizmadır. Meningokok, sağlıklı öznenin yaklaşık %10’unun insan nazofapolisinin geçici bir kolonisidir. Özellikle durumlarda, mukozal bariyeri aşmak için invaziv bir yetenek kazanır ve septisemi neden kan dolaşımını işgal. Son durumda, fulminating sepsis bile menenjit sonucu gelişimi olmadan ortaya çıkabilir. Tersine, bakteriler kötü kan dolaşımında çoğalmak olabilir, kan beyin bariyerini geçmek, merkezi sinir sistemine ulaşmak, fulminant menenjit yol. Bakteriyel menenjit in murine modelleri konak-patojen etkileşimlerini araştırmak ve bu ölümcül hastalıktan sorumlu patogenetik mekanizmaları analiz etmek için yararlı bir araç tır. Son yıllarda birçok deneysel model sistemi değerlendirilmiş olsa da, bunların hiçbiri meningokok hastalığının karakteristik patolojik olaylarını yeniden üretememiştir. Bu deneysel protokolde, bakterilerin intrasisternal aşılamadayalı bir fare modelimeningokok menenjit indüksiyonu için ayrıntılı bir prosedür açıklanır. İnsan menenjitinin kendine özgü belirtileri klinik parametrelerin (örn. sıcaklık, vücut ağırlığı), sağkalım oranının değerlendirilmesi, mikrobiyolojik analiz ve beyin hasarının histolojik incelemesi ile mürin konakta kaydedildi. Intrasisternal kullanırken (i.cist.) inoculum, meningokok doğrudan sarnıç magna içine teslim, beyin dokusunda çok verimli bir meningokok replikasyonu yol. Bakterilerin canlı sayısında 1.000 kat artış yaklaşık 18 saat içinde gözlenmektedir. Ayrıca, meningokokda dalalak ve enfekte farelerin karaciğerbulunur, karaciğer meningokok replikasyonu için bir hedef organ temsil edebilir düşündüren.
Introduction
Neisseria menenjitidis, dünya genelinde insan popülasyonunda menenjit ve sepsisin en yaygın nedenlerinden biri olarak bilinen, insan konakçısı ile sınırlı bir Gram negatif β-proteobacteriumdur. Bu sağlıklı ve asemptomatik taşıyıcıların üst solunum yolu (burun ve boğaz) kolonize (nüfusun% 2-30), ama bakteri bazen çeşitli konak bağışıklık savunma kaçar ve kontrolsüz bir lokal neden beyne kan dolaşımından yayılır meningokok menenjiti olarak bilinir. Konak ve bakteriyel faktörlerin bir kombinasyonu invaziv davranış1commensal geçiş katkıda bulunmak için görünür.
N. menenjitidis insan kolonizasyonu ve enfeksiyon sadece uzmanlaşmıştır. Bu dar bir konak aralığı vardır ve bu nedenle, insan meningokok hastalığı çoğaltmak uygun hayvan modelleri eksikliği nedeniyle in vivo patogenez çalışmaları sınırlıdır. Sonuç olarak, meningokokların neden olduğu septisemi ve menenjit patogenezine ilişkin anlamada temel boşluklara yol açmıştır. Son yıllarda, birçok in vitro sistemlerin geliştirilmesi birkaç meningokok virülansfaktörlerininbelirlenmesine izin 2,3,4. Bu değerli çalışmalar başarılı bir meningokok enfeksiyonu için bu faktörlerin rolünü anlamak için önemli anlayışlar sağlamış olsa da, bu modeller mizahi ve hücresel ile bakteri etkileşimlerinin sonuçlarının değerlendirilmesine izin vermedi bağışıklık sistemi ve hatta daha az tüm doku ile. In vivo hayvan enfeksiyon modelleri aşı formülasyonları tarafından verilen koruma derecesinin değerlendirilmesi için de büyük önem ehemdir. İnsan-tropik bir patojen olarak meningokoklar, yüzey yapıları (örneğin, tip IV pili ve opaklık proteinleri) ve insan reseptörleri ve taşıma proteinleri için demir alım sistemleri (yani, transferrin ve laktoferrin)5,6,7 düzgün uymak, hayatta kalmak ve insan konak işgal. Son olarak, patojengenetik varyasyon yetenekleri kaçınmak ve / veya insan bağışıklık yanıtı engellemek için daha yüksek türler tropizmkatkıda 8,9. Bu nedenle, etkileşimde yer alan belirli konak faktörlerin yokluğu, meningokok yaşam döngüsünü özetleyen küçük hayvan modellerinin gelişiminde önemli zorluklar oluşturarak, patojenin yaşam döngüsünün adımlarını engelleyebilir.
Son yıllarda meningokok enfeksiyöz döngüsünü anlamamızı geliştirmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Meningokok hastalığı10,11 ,12,13,14 üremek için iki hayvan modeli, fare ve sıçan, intraperitoneal (yani) veya intranasally (i.n.) enfeksiyonları geliştirilmiştir ,15,16,17. Laboratuvar faresi muhtemelen deneysel meningokok enfeksiyonu indükleyen daha çok yönlü hayvanlardan biridir.
Ancak, i.p. enfeksiyonun yolu, doğal enfeksiyon rotasını taklit etmese de şiddetli sepsis gelişimine yol açarken, enfeksiyon yolu meningokok patogenezi değerlendirmek için yararlı olurken, akciğer enfeksiyonuna neden olsa da önce sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
I.p. fare modeli meningokok meydan10,11,12koruma değerlendirmek için etkili oldu. İnfeksiyonun i.n. rotasına dayalı meningokok kolonizasyonunun fare modeli, erkeklere daha yatkın oldukları için, insanlarda meningokok hastalığının seyrini taklit eden invaziv bir enfeksiyonu yeniden üretmek için bebek farelerle geliştirilmiştir. 13,14,15,16,17. Ayrıca, minür konak meningokok replikasyonunu teşvik etmek için, teknik stratejiler artan sayıda da enfeksiyon geliştirmek için hayvanlara demir yönetimi de dahil olmak üzere uygulanmıştır, yüksek bakteriyel inoculumkullanımı , fare-geçitli bakteriyel suşu yanı sıra bebek veya bağışıklık tehlikeye hayvan istihdam10,13,15,18,19. CD4620 veya transferrin21 gibi belirli insan faktörlerinin ifadesi farelerin bu insan-tropik bakteriye duyarlılığını artırmıştır; enfeksiyon insan deri ksenogreft modelinin istihdam da insan endotel22,23meningokokların adezyon yeteneğini değerlendirmek için yararlı olmuştur. İnsanlaşmış transgenik farelerin son gelişimi meningokok patogenezi ve konak etkileşimlerinin anlaşılmasını iyileştirmiştir.
Daha önce, biz bakteri aşılama fare geçitli bakteriler ile yetişkin farelerin sarnıç magna içine yapıldı meningokok menenjit bir minür modeli geliştirdi24. Enfekte farelerin klinik parametreleri ve sağkalım oranı, beyin de görülen lerin yanı sıra beynin mikrobiyolojik ve histolojik analizlerine benzer özelliklere sahip menenjitin oluşmasını göstermiştir. Bu enfekte fareler, bakteriler de, kan kurtarıldı, karaciğer, ve dalak, ve çevresel organlardan bakteriyel yükler bulaşıcı doz ile ilişkili. Özellikle, Bu model L-glutamat taşıyıcı GltT kusurlu bir iyojenik mutant suşu virülansını değerlendirmek için kullanılmıştır24. Son zamanlarda, i.cist dayalı meningokok menenjit bizim fare modeli kullanarak. serogroup C suşu ile rota 93/42862,24 ve udp-N-asetilglukozamin 2-epimerase25için cssA gen kodlama bir izojenik mutant kusurlu , biz işyerinde maruz siyalik asit rolünü analiz ettik farelerde hastalık.
Bu protokolde, i.cist’e dayalı deneysel meningokok menenjitini tetiklemek için basit bir yöntem tanımlıyoruz. Balb/c yetişkin farelerde enfeksiyon rotası. Bu yöntem özellikle bir mingokok konakmeningokok enfeksiyonunun karakterizasyonu için yararlı dır, yanı sıra yabani tip referans suşları ve izojenik mutantlar arasındaki virülans değerlendirilmesi için. Enfeksiyonun sarnıç içi güzergahı meningokokların doğrudan sarnıktan magna’ya tam olarak ulaşmasını sağlar, bu da beyin omurilik sıvısında (BOS) bakteri çoğalmasını kolaylaştırır ve menenjiti taklit eden özelliklere neden olur. insanlarda mevcut2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada erişkin farelerde meningokok menenjitini i.cist ile indükleyen deneysel bir protokol açıklanır. meningokok bakterilerinin aşılanması. Bilgimiz dahilinde, i.cist tarafından enfekte edilen laboratuvar farelerinde başka hiçbir meningokok menenjit modeli geliştirilmemiştir. rota; Geçmişte, bu şekilde hem sıçan31 ve tavşan32meningokok menenjit modelleri sağlamak için keşfedilmiştir. Meningokok hastalığının en yüksek oranının küçük…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalar kısmen PRIN 2012 [hibe numarası 2012WJSX8K] tarafından desteklenmiştir: “Mukozal enfeksiyonlarda host-mikrop etkileşim modelleri: yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi” ve PRIN 2017 [2017SFBFER]: “Aralarındaki etkileşimi ele almak için entegre bir yaklaşım adaptasyon, stresli koşullar ve zorlu patojenlerin antimikrobiyal direnci”.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
Riferimenti
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 – Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
