Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro
Summary
A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.
Abstract
O transplante de medula óssea alogênico (TMO) é uma terapia eficaz para malignidades hematológicas devido ao efeito enxerto versus leucemia (GVL) para erradicar tumores. No entanto, sua aplicação é limitada pelo desenvolvimento da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), uma grande complicação da TMO. GVHD é evocado quando as células T nos enxertos doadores reconhecem alloantigen expresso por células receptoras e montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos saudáveis receptores. Assim, as terapias tradicionais são projetadas para suprimir a aloreatividade das células T do doador. No entanto, essas abordagens prejudicam substancialmente o efeito GVL para que a sobrevivência do destinatário não seja melhorada. Compreender os efeitos das abordagens terapêuticas em TMO, GVL e GVHD é, portanto, essencial. Devido às capacidades de apresentação de antígenos e secreção de citocinas para estimular células T doadoras, as células dendríticas receptoras (DCs) desempenham um papel significativo na indução do GVHD. Portanto, direcionar dCs destinatários torna-se uma abordagem potencial para controlar o GVHD. Este trabalho fornece uma descrição de uma nova plataforma de TMO para investigar como os DCs host regulam as respostas GVH e GVL após o transplante. Também é apresentado um modelo eficaz de TMO para estudar a biologia do GVHD e gvl após o transplante.
Introduction
O transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas (TMO) é uma terapia eficaz para tratar malignidades hematológicas1,2 através do efeito enxerto-versus-leucemia (GVL)3. No entanto, os linfócitos doadores sempre montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos receptores, um processo chamado doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)4.
Os modelos murine de GVHD são uma ferramenta eficaz para estudar a biologia do GVHD e a resposta GVL5. Camundongos são um modelo animal de pesquisa econômico. São pequenos e eficientemente dosados com moléculas e biológicas nas fases iniciais do desenvolvimento6. Camundongos são animais de pesquisa ideais para estudos de manipulação genética por serem geneticamente bem definidos, o que é ideal para estudar caminhos biológicos e mecanismos6. Vários modelos de complexo de histocompatibilidade maior estrito do mouse (MHC) MHC-incompatíveis de GVHD foram bem estabelecidos, tais como C57BL/6 (H2b) para BALB/c (H2d) e FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Estes são modelos particularmente valiosos para determinar o papel de tipos de células individuais, genes e fatores que afetam o GVHD. Transplante de C57/BL/6 (H2b) doadores parentais para receptores com mutações no MHC I (B6.C-H2bm1) e/ou MHC II (B6.C-H2bm12) revelaram que uma incompatibilidade tanto na classe MHC I quanto na classe II é um requisito importante para o desenvolvimento do GVHD agudo. Isso sugere que tanto as células CD4+ quanto CD8+ T são necessárias para o desenvolvimento da doença7,8. GVHD também está envolvido em uma cascata inflamatória conhecida como a “tempestade de citocinas pró-inflamatórias”9. O método de condicionamento mais comum em modelos de murina é a irradiação corporal total (TBI) por raio-X ou 137Cs. Isso leva à ablação da medula óssea do receptor, permitindo assim o enxerto de células-tronco do doador e prevenindo a rejeição do enxerto. Isso é feito limitando a proliferação de células T receptoras em resposta às células doadoras. Além disso, as disparidades genéticas desempenham um papel importante na indução da doença, que também depende da menor incompatibilidademhc-incompatível 10. Portanto, a dose mieloablativa de irradiação varia em diferentes cepas de camundongos (por exemplo, BALB/c→C57BL/6).
A ativação de células T doadoras por células apresentadoras de antígenos hospedeiros (APCs) é essencial para o desenvolvimento do GVHD. Entre os APCs, as células dendríticas (DCs) são as mais potentes. Eles são herdavelmente capazes de induzir GVHD devido à sua captação superior de antígenos, expressão de moléculas co-estimuladoras de células T e produção de citocinas pró-inflamatórias que polarizam as células T em subconjuntos patogênicos. Os DCs receptores são fundamentais para facilitar a escorva de células T e a indução de GVHD após o transplante11,12. Assim, os DCs tornaram-se alvos interessantes no tratamento do GVHD12.
O TCE é necessário para melhorar o enxerto celular do doador. Devido ao efeito TBI, os DCs receptores são ativados e sobrevivem por um curto período de tempo após o transplante12. Apesar dos grandes avanços no uso da bioluminescência ou fluorescência, estabelecer um modelo eficaz para estudar o papel dos DCs receptores no GVHD ainda é desafiador.
Como as células T doadoras são a força motriz para a atividade da GVL, estratégias de tratamento usando drogas imunossupressoras, como esteróides, para suprimir a aloreatividade das células T, muitas vezes causam recaída ou infecçãotumoral 13. Portanto, direcionar os DCs receptores pode fornecer uma abordagem alternativa para tratar o GVHD, preservando o efeito GVL e evitando a infecção.
Em resumo, o presente estudo fornece uma plataforma para entender como diferentes tipos de sinalização em DCs receptoras regulam o desenvolvimento de GVHD e o efeito GVL após o TMO.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de células-tronco para se adequar a um indivíduo específico é uma abordagem eficaz para tratar cânceres avançados e resistentes18. Os fármacos de pequenas moléculas, no entanto, têm permanecido por muito tempo um foco primário da terapia personalizada contra o câncer. Por outro lado, na terapia celular uma infinidade de interações entre doador e hospedeiro pode influenciar decisivamente os desfechos do tratamento, como o desenvolvimento do GVHD após a TMO1</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é apoiado pela Bolsa inicial da University of Central Florida College of Medicine (à HN), pela bolsa inicial do Centro Médico hillman Hillman (para a HL), pelo Bolsa de #1P20CA210300-01 do Ministério da Saúde dos Estados Unidos #4694 (para a PTH). Agradecemos ao Dr. Xue-zhong Yu da Universidade Médica da Carolina do Sul por fornecer materiais para o estudo.
Materials
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | Fisher Scientific | BP2482100 | MACS buffer |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP3994 | MACS buffer |
| A20 B-cell lymphoma | University of Central Florida | In house | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl | Jackson Lab | 30954 | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl CD4cre | University of Central Florida | GVL experiment | |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | T-cell enrichment |
| Anti-Human/Mouse CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-85 | T-cell enrichment |
| Anti-mouse B220 FITC | Thermo Fisher Scientific | 10452-85 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse CD11c- AF700 | Thermo Fisher Scientific | 117319 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD25 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0251-82 | Flow staining |
| Anti-Mouse CD4 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0041-86 | T-cell enrichment |
| Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-82 | Flow staining |
| Anti-mouse CD45.1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0900-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD8a APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0081-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5958-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse MHC Class II-antibody APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5320-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse TER-119 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-85 | T-cell enrichment |
| Anti-Thy1.2 | Bio Excel | BE0066 | BM generation |
| B6 fB-/- mice | University of Central Florida | In house | Recipients |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice | Charles River | 564 | Donors |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | Transplant recipients |
| C57BL/6 mice | Charles River | 027 | Donors/Recipients |
| CD11b | Thermo Fisher Scientific | 13-0112-85 | T-cell enrichment |
| CD25-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0251-82 | T-cell enrichment |
| CD45R | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-82 | T-cell enrichment |
| CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5971-82 | T-cell enrichment |
| Cell strainer 40 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | Cell preparation |
| Cell strainer 70 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | Cell preparation |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | Live animal imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Bilogicals R&D system | D17051 | Cell Culture |
| Flow cytometry tubes | Fisher Scientific | 352008 | Flow cytometry analysis |
| FVB/NCrl | Charles River | 207 | Donors |
| Lipopolysacharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391-1MG | DC mature |
| LS column | Mitenyi Biotec | 130-042-401 | Cell preparation |
| MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | T-cell enrichment |
| New Brunswick Galaxy 170R incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | Cell Culture |
| Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | Media |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scienctific | 11875-093 | Media |
| TER119 | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-82 | T-cell enrichment |
| Xenogen IVIS-200 | Perkin Elmer | Xenogen IVIS-200 | Live animal imaging |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-RAY | X-RAD 320 | Total Body Irradiation |
Riferimenti
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