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Medicina

Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

Published: November 27, 2019
doi:
10.3791/60146
, , , , , , , , , ,
1National Institute of Immunology, 2Center for Cellular and Molecular Biology

Summary

Il modello animale acuto di insufficienza epatica sviluppato nell’attuale studio presenta un’alternativa fattibile per lo studio di potenziali terapie. L’attuale modello utilizza l’effetto combinato di lesioni epatiche fisiche e farmacologiche e fornisce una finestra temporale adatta per studiare il potenziale di nuove terapie.

Abstract

L’insufficienza epatica acuta (ALF) è una condizione clinica causata da varie eziologie con conseguente perdita di funzioni metaboliche, biochimiche, sintetizzanti e disintossicanti del fegato. Nella maggior parte dei casi di danni al fegato irreversibili, trapianto di fegato ortotropico (OLT) rimane l’unico trattamento disponibile. Per studiare il potenziale terapeutico di un trattamento per ALF, è essenziale il suo test precedente in un modello animale di ALF. Nello studio attuale, è stato sviluppato un modello ALF nei ratti combinando il 70% di epatectomia parziale (PHx) e iniezioni di acetaminofene (APAP) che fornisce una finestra terapeutica di 48 h. I lobi laterali mediani e lasciati del fegato sono stati rimossi per accise 70% della massa epatica e APAP è stato dato 24 h postchirurgico per 2 giorni. La sopravvivenza negli animali indotti da ALF è risultata essere gravemente diminuita. Lo sviluppo di ALF è stato confermato da livelli alterati di siero degli enzimi alanine aminoasi (ALT), aminoatomomomomomosoe aspartato (AST), fosfatosi alcalina (ALP); cambiamenti nel tempo protrombina (PT); e valutazione del rapporto internazionale normalizzato (INR). Lo studio del profilo di espressione genica da parte di qPCR ha rivelato un aumento dei livelli di espressione dei geni coinvolti nell’apoptosi, nell’infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La degenerazione diffusa degli epatociti e l’infiltrazione delle cellule immunitarie è stata osservata mediante valutazione istologica. La reversibilità di ALF è stata confermata dal ripristino dei livelli di sopravvivenza e siero di ALT, AST e ALP dopo il trapianto intrasplenico di epatociti di ratti sani sinosgenici. Questo modello presenta un’alternativa affidabile ai modelli animali ALF disponibili per studiare la fisiofisiologia di ALF e per valutare il potenziale di una nuova terapia per ALF. L’uso di due approcci diversi consente inoltre di studiare l’effetto combinato delle lesioni epatiche fisiche e indotte da farmaci. La riproducibilità e la fattibilità della procedura corrente è un ulteriore vantaggio del modello.

Introduction

L’insufficienza epatica acuta (ALF) è definita dall’Associazione Americana per lo Studio delle Malattie del Fegato come rapido sviluppo di lesioni epatiche acute senza segni previi di danno ed è caratterizzata da una grave compromissione delle funzioni sintetiche, metaboliche e disintossicanti del fegato1. ALF si differenzia dall’insufficienza epatica cronica in cui l’insufficienza si verifica a causa di lesioni epatiche causate per un lungo periodo di tempo e da insufficienza epatica cronica acuta (ACLF), dove si verificano danni epatici bruschi a causa di malattie epatiche croniche2,3,4. L’unica cura disponibile per ALF è il trapianto di fegato ortotopico (OLT), o la morte può verificarsi. A causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.

Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiofisiologia dell’ALF, sono necessari modelli animali che possano riflettere l’ALF che si verifica negli esseri umani. Molti dei modelli animali ALF già disponibili presentano diverse carenze. Gli effetti dell’acetaminofene (APAP) sono difficili da riprodurre, ma hanno le somiglianze più vicine in termini di parametri temporali, clinici, biochimici e patologici. I modelli animali indotti da APAP- incontrano spesso problemi dovuti alla presenza di methemoglobinemia causata dall’ossidazione dell’emoglobina da parte dell’APAP e dei suoi intermedi5,6,7. Un altro problema è la mancanza di riproducibilità riflessa da risposte imprevedibili alla dose e l’ora della morte. I modelli animali ALF prodotti con tetra cloruro di tetra di carbonio (CCl4) hanno scarsa riproducibilità8,9,10,11. I modelli animali ALF indotti da Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) non riflettono il modello clinico della malattia umana, anche se hanno vantaggi nello studio dei meccanismi cellulari coinvolti nelle malattie epatiche autoimmuni e nello studio della sepsi rispettivamente12,13,14,15. Allo stesso modo, la tioacetamide (TAA) richiede anche la biotrasformazione in un metabolita attivo di tioacetamide e mostra la variazione delle specie16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce alcuni cambiamenti biochimici, metabolici e fisiologici simili a ALF ma non è in grado di riflettere l’intera condizione patologica ALF20,21,22,23. Ci sono stati pochissimi tentativi di combinare due o più di questi metodi per sviluppare un modello ALF che è in grado di riflettere la sindrome ALF in modo migliore13. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per sviluppare un modello in grado di riflettere i parametri della malattia, ha una migliore riproducibilità e fornisce abbastanza tempo per studiare gli effetti di un intervento terapeutico.

Nello studio attuale, è stato creato un modello alternativo ALF nei ratti combinando gli effetti dell’epatectomia parziale (PHx) e le dosi più basse di un reagente epatotossico. APAP ha un ruolo ben consolidato nel causare lesioni epatiche5,24,25. È un analgesico ampiamente usato ed è tossico per il fegato a dosi sopraterapeutiche formando metaboliti tossici. L’APAP è la causa di molti decessi nei paesi sviluppati. La lesione fisica causata dall’epatectomia parziale avvia l’attivazione di vari processi coinvolti nell’infiammazione e nella rigenerazione del fegato. L’iniezione dell’agente epatotossico APAP provoca un ambiente ostile nel fegato, impedendo la proliferazione di epatociti. Questo riduce il periodo di stress sull’animale, che quando combinato con piccole dosi di epatotossina, porta a una migliore riproducibilità della procedura. Pertanto, utilizzando questo modello, è stato studiato un effetto combinatorio di due tipi di lesioni epatiche. Per caratterizzare il modello animale ALF sviluppato, sono stati studiati i parametri fisiologici e biochimici. Una corretta reversibilità di ALF è stata confermata dal trapianto di epatociti di ratto sano singenico.

Protocol

La procedura descritta di seguito è stata approvata dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali dell’Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell’omologazione è IAEC-355/14. 1. Preparazione Preparare la procedura chirurgica come descritto in precedenza da Das B et al.26. Usa ratti Wistar inbred di 6-8 settimane con un peso corporeo di 200-250 g. Alloggiare gli animali in condizioni standard di c…

Representative Results

Percentuale di sopravvivenza nei modelli animali di ALFLa dose ottimale di APAP per causare ALF in combinazione con 70% PHx è stato standardizzato come 750 mg/kg peso corporeo. Il regime di trattamento è iniziato 24 h dopo 70% PHx, quando gli animali si erano completamente ripresi dall’intervento chirurgico, e consisteva di due dosi di APAP a intervalli di 24 h. La mortalità è stata osservata al tasso dell’80% dopo la somministrazione della seconda dose di APAP, 48 h post-intervento chirurgico. L…

Discussion

Lo sviluppo di un modello animale appropriato per ALF è fondamentale per una migliore comprensione della patogenesi e della progressione di ALF. Un modello animale ALF ben caratterizzato offre anche l’opportunità per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici contro ALF. Sono stati fatti molti tentativi per sviluppare un modello clinicamente rilevante di ALF6,12,21,23…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione di base ricevuta dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell’India all’Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi.

Materials

Acetaminophen (Biocetamol) EG Pharmaceuticals No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA) Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser Tulip, Alto Santracruz, India Screen Maaster 3000 Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution) Win-Medicare; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I) Kartos international; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope Olympus, Japan LX51
Cefotaxime (Taxim®) AlKem; India cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer Sigma; US CLS431752
Collagenase Type I Gibco by Life Technologies 17100-017
Cotton Buds Pure Swabs Pvt Ltd; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet JSD Surgicals, Delhi, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant Sigma; US 6522
Eosin Y solution, alcoholic Sigma; US HT110132
Forceps Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System Ugo Basile; Italy 211000
Glucose Himedia, India GRM077
Hair removing cream (Veet®) Reckitt Benckiser, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's Sigma; US MHS16
Heparin sodium salt Himedia; India RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes Sigma; US H6254
I.V. Cannula (Plusflon) Mediplus, India Ref 1732411420
Insulin Syringes BD; US REF 303060
Isoflurane (Forane®) Asecia Queenborough No B506 Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®) Troikaa Pharmaceuticals Ltd. Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®) Intas Pharmaceuticals Ltd; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight &
curved		 Mercian; England BS-13-8
Micro needle holders straight &
curved		 Mercian; England BS-13-8
Microtome Histo-Line Laboratories, Italy MRS3500
Nylon Thread Mighty; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde Himedia; India GRM 3660
Percoll® GE Healthcare 17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India P3060 No specific Catalog Number
RPMI Himedia; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat Thermo Electron Corporation; US No specific Catalog Number
Sucrose Sigma; US S0389
Surgical Blade No. 22 La Medcare, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board Locally made No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape 3M India; India 1530-1 Micropore Surgical Tape
Sutures Ethicon, Johnson & Johnson, India NW 5047
Syringes (1ml, 26 G) Dispo Van; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper) Philips NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine Braun No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media Himedia; India AT125
Xylazine (Xylaxin®) Indian Immunologicals Limited Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant
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Riferimenti

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Sahay, P., Jain, K., Sinha, P., Das, B., Mishra, A., Kesarwani, A., Sahu, P., Mohan, K. V., Kumar, M. M., Nagarajan, P., Upadhyay, P. Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen. J. Vis. Exp. (153), e60146, doi:10.3791/60146 (2019).
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