Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti
Summary
Qui, descriviamo un metodo di microaspirazione a singola cellula per la separazione delle amebe infette. Al fine di separare le sottopopolazioni virali in Vermamoeba vermiformis infettate da Faustovirus e virus giganti sconosciuti, abbiamo sviluppato il protocollo descritto di seguito e dimostrato la sua capacità di separare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza.
Abstract
Durante il processo di co-coltura dell’ameba, più di un virus può essere isolato in un unico pozzo. In precedenza abbiamo risolto questo problema per diluizione all’estremità e/o la fluorescenza, applicato alla popolazione virale per la diluizione e/o la fluorescenza. Tuttavia, quando i virus nella miscela hanno proprietà morfologiche simili e uno dei virus si moltiplica lentamente, la presenza di due virus viene scoperta nello stadio di assemblaggio del genoma e i virus non possono essere separati per un’ulteriore caratterizzazione. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una procedura di microaspirazione a singola cellula che consente la separazione e la clonazione di virus altamente simili. Nel presente lavoro, presentiamo come questa strategia alternativa ci ha permesso di separare le piccole sottopopolazioni virali del Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, virus giganti che crescono lentamente e non portano a lisi ameaka rispetto alla litetica e in rapida crescita Faustovirus. Il controllo della purezza è stato valutato da specifici virus e amplificazione genica per un’ulteriore caratterizzazione.
Introduction
I virus del DNA di grandi dimensioni nucleocitoplasmatici (NCLDV) sono estremamente diversi, definiti da quattro famiglie che infettano gli eucarioti1. I primi virus descritti con genomi superiori a 300 kbp sono stati Phydcodnaviridae, tra cui il virus paramecium bursaria Chlorella 1 PBCV12. L’isolamento e la prima descrizione di Mimivirus, ha mostrato che la dimensione dei virus è raddoppiata sia in termini di dimensioni della particella (450 nm) che di lunghezza del genoma (1,2 Mb)3. Da allora, sono stati descritti molti virus giganti, di solito isolati utilizzando una procedura di co-coltura ameba. Diversi virus giganti con diverse morfologie e contenuti genetici possono essere isolati dalle cellule di Acanthamoeba sp., tra cui Marseillevirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, e recentemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelamente, l’isolamento di Vermamoeba vermiformis ha permesso l’isolamento e la descrizione dei virus giganti Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus18,19,20. Altri virus giganti sono stati isolati con i loro protisti ospiti, come Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, e Bodo saltans 24. Tutti questi isolati sono il risultato di un numero crescente di team che lavorano sull’isolamento e dell’introduzione di aggiornamenti della strategia ad alta velocità effettiva25,26,27,28, come il miglioramento del sistema di cocoltura con l’uso della citometria di flusso.
Nel 2016 abbiamo utilizzato una strategia che associa la cocultura e la citometria di flusso per isolare i virus giganti27. Questa strategia è stata sviluppata per aumentare il numero di campioni inoculati, per diversificare i protisti usati come supporti cellulari e per rilevare rapidamente la lisi del supporto cellulare. Il sistema è stato aggiornato aggiungendo un passo supplementare per evitare l’identificazione preliminare della biologia molecolare e la rapida individuazione di una popolazione virale sconosciuta come nel caso del Pacmanvirus29. La citometria del flusso di accoppiamento allo smistamento cellulare ha permesso la separazione di una miscela di Mimivirus e Cedratvirus A1130. Tuttavia, in seguito abbiamo incontrato i limiti della separazione e del rilevamento di queste sottopopolazioni virali per citometria di flusso. Dopo il sequenziamento, quando abbiamo assemblato i genomi di Faustovirus ST125 e Faustovirus LCD7 (dati inediti), abbiamo sorprendentemente trovato in ogni assemblaggio due genomi supplementari di due nuovi virus non identificati nei database pubblici del genoma. Tuttavia, né la citometria di flusso né la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) hanno mostrato che le amebe sono state infettate da due virus diversi, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Abbiamo progettato sistemi PCR specifici per amplificare i marcatori Faustovirus, Usurpativirus e Clandestinovirus rispettivamente in base ai loro genomi; il nostro scopo era quello di avere sistemi pcR-based che consentono la verifica della purezza dei virus separati. Tuttavia, la diluizione dell’estremità puntino e la citometria di flusso non sono riusciti a separarli. L’isolamento di questa singola popolazione virale è stato difficile perché non sono stati caratterizzati né la morfologia né gli elementi replicativi delle popolazioni di Clandestino virus e Usurpativirus. Abbiamo rilevato una sola popolazione virale per citometria di flusso a causa della sovrapposizione delle due popolazioni (testata dopo l’effettiva separazione). Abbiamo cercato di separarli usando lo smistamento di singole particelle su piastre di 96 pozzi, ma non abbiamo osservato alcun effetto citopatico, e abbiamo rilevato né Il Clandestinovirus né l’Usurpativirus dall’amplificazione PCR. Infine, è stata solo la combinazione di diluizione del punto finale seguita da una singola micro-aspirazione di ameba che ha permesso la separazione di questi due virus giganti a bassa abbondanza dai Faustovirus. Questo metodo di separazione è l’oggetto di questo articolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La durata della gestione della microaspirazione a cella singola e il suo buon funzionamento dipendono dall’operatore. Le diverse fasi dell’esperimento richiedono precisione. L’uso dei componenti di micromanipolazione della postazione di lavoro deve essere sotto costante controllo osservando il processo di microaspirazione e il rilascio della cellula. Il follow-up per osservazione microscopica è necessario per la cattura e il trasferimento di una cellula. Un operatore esperto può prendere da 1 a 2 h per isolare 10 cellu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare sia Jean-Pierre Baudoin che Olivier Mbarek per i loro consigli e Claire Andréani per il suo aiuto nelle correzioni e nelle modifiche inglesi. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dello Stato francese gestita dall’Agenzia nazionale di ricerca nell’ambito del programma “Investissements d’avenir (Investments for the Future)” con il riferimento ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) e dal Région Provence Alpes Costa Azzurra e finanziamento europeo FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
Riferimenti
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