Summary
此处介绍的是一种协议,用于将藻酸盐作为聚合物在永生细胞的微封装中,用于长期向啮齿动物的眼睛提供生物制剂。
Abstract
目前许多正在开发治疗后视点疾病的治疗方法都是生物制剂。这些药物需要经常施用,通常通过静脉注射。表达选择的生物学的封装细胞正在成为当地蛋白质生产和释放的工具(例如,通过长期药物输送)。此外,封装系统利用可渗透材料,允许将营养物质、废物和治疗因素扩散到细胞中和细胞外。这发生在遮蔽宿主免疫反应的细胞时,避免了对宿主免疫系统的抑制。该协议将藻酸盐作为微封装中的聚合物与电喷法一起描述为一种微封装技术。ARPE-19细胞是一种自发产生的人类RPE细胞系,由于其终身功能,已用于长期细胞治疗实验,并在这里用于胶囊的封装和向小鼠眼睛的传递。手稿总结了细胞微封装、质量控制和眼部传递的步骤。
Introduction
细胞疗法代表了在医学上广泛应用的革命性生物技术。最近,它们已成功应用于神经退行性疾病、眼疾和癌症的治疗。细胞疗法涵盖从细胞替代到药物输送的广泛领域,该协议侧重于后者。可生物降解的藻酸盐微胶囊(MC)作为一种输送系统已经显示出有效性,并且正在生物医学领域得到广泛应用。Alginate 由于其简单的凝胶工艺、生物降解性、优,异的生物相容性以及1、2、323、44在体内条件下的稳定性,一直用于微封装。
电喷法作为一种微封装技术,已成功利用藻酸盐(基聚合物)和聚l-ornithine(二次涂层聚合物)来封装肽和蛋白质。两种聚合物都是自然发现的,并用于其生物相容性,5,6,7。,7然而,在基于细胞的疗法的主要挑战是抑制宿主免疫系统,以避免免疫抑制药物引起的副作用。藻酸盐微胶囊的渗透性被认为是细胞封装的合适特性,它允许将营养物质、废物和治疗因子扩散到细胞中,同时将其从宿主免疫反应88、9、109,10中屏蔽。
在眼睛中,封装细胞被用于临床试验,以持续传递生物制剂(即生长因子11,12,12和生长因子拮抗剂13)用于治疗视网膜炎色素瘤或年龄相关的黄斑变性。其他目标,如补充抑制剂14目前正在临床前环境中探索。
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Protocol
所有实验均根据《动物在眼科和视力研究中使用ARVO声明》进行,并经南卡罗来纳医科大学动物护理和使用委员会根据协议ID00399批准。
1. 细胞培养
- 根据公布的协议14、15,,15生成人类视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)细胞系,稳稳地表达选择的基因。
- 维持Dulbecco改良鹰中(DMEM)中的细胞,辅以10%的胎儿牛血清(FBS)。
- 在37°C和5%CO2孵育细胞。2
- 每 2-3 天更换一次介质。
- 使用标准组织培养程序,在达到70%-80%汇合后通过细胞。
2. 细胞封装
- 将藻酸钠与去离子化 (DI) 水混合,最终浓度为 2% w/v,并通过过滤使用 0.2 μm 无菌注射器过滤器进行纯化。
- 通过试血、离心和用10 mM HEPES缓冲盐水溶液(pH = 7.4)清洗细胞,使细胞与藻酸盐溶液混合。使用血细胞计,对细胞进行计数,并将最终细胞浓度调整到1 x 106在藻酸盐溶液中。
注:封装过程应在消毒罩内运行。 - 将藻酸盐和细胞混合物的 +300 μL 等分物装入 3 mL 注射器,并将其连接到注射器泵上。溶液将通过30 G钝尖针泵送至无菌凝胶浴,放在注射器尖端下方的无菌50mL烧杯中,7 mm,用于针头到浴喷涂距离。
- 凝胶浴含有40 mL的体积10mM HEPES缓冲盐水,含有100m氯化钙(CaCl2)和0.5%的多L-L-球类(PLO)。PLO 是一种二次聚合物涂层,可根据调查员的需要进行省略或更改。
- 在封装过程中,以 60 mm/h 的流速和 6.0 kV 初始电压调整电压和流速并保持两个恒定,从而产生 150 μm 的微胶囊尺寸。
- 将高压发电机针尖的阳极线(红色)夹连接到针头,并将接地夹(黑色)连接到半浸于凝胶槽中的铜线。一批藻酸盐 + 细胞混合物 (1 mL) 大约需要 30 分钟才能制备封装的细胞(大约 25,000 微胶囊)。
- 用洗涤溶液(10 mM HEPES缓冲盐水,含有1.5m CaCl 2,pH =27.4)清洗含有细胞的成型微胶囊。请勿使用 PBS 进行清洗。
- 在37°C和5%CO2的加湿培养箱中孵育封装的细胞与10%FBS补充DMEM培养基2体。
注:封装过程仪器如图1所示。
3. 确认封装不会影响细胞生存能力
- 在培养24小时后,制备500 μL(+30微胶囊)的小样本进行染色。
- 使用洗涤溶液(10 mM HEPES 缓冲盐水,含有 1.5 mM CaCl2)清洗微胶囊 2 倍,并使用活/死测定试剂盒染色,使其活死生存能力。
- 在最终浓度分别为2μM和4μM时制备钙素AM(乙氧甲基)和乙酰氨基甲酰胺-1的染色混合物。
- 将 2 mL 染色混合物添加到封装的细胞中,在室温 (RT) 下在黑暗中孵育 30-45 分钟。
- 小心地吸气染色溶液,用洗涤液洗涤2倍。使用荧光显微镜系统观察和成像封装的细胞。
注:封装的文档如图2所示。
4. 确认胶囊是生物制剂的交付和交付的适当尺寸
- 小鼠眼睛的静脉注射通常使用 27 G 钝尖针(内径 210 μm)连接到 2.5 μL Hamilton 注射器。
- 生成 100 至 200 μm 的胶囊,在无血清介质中稀释,并小心地将其拉入 Hamilton 注射器中。PBS 不是合适的车辆,因为藻酸盐胶囊会溶解在 PBS 中。
- 将含有胶囊的1μL滴缓慢地喷射到显微镜滑道上,并使用直立的明亮场显微镜确定其完整性。
- 通过相应地调整电压和流速来调整胶囊尺寸(参见步骤 2.3)。较小的微胶囊通过增加电压和稍微降低流速8以非线性方式产生。在我们手中,直径为150μm的胶囊被证明是最合适的。调整胶囊大小还取决于在改变其他参数时保持藻酸盐浓度恒定。
- 在无血清介质中,在适当大小的胶囊中保持一组单独的细胞,以确定所需生物的分泌量。使用敏感的ELISA或西方印迹来确定上清液中生物制剂的浓度。
- 根据治疗的已知PK/PD(药代动力学/药理动力学)确定需要注射的胶囊数量。在我们手中,每只老鼠眼10粒胶囊被证明是最有效的。
5. 胶囊交付到老鼠Vitreous
- 使用解剖显微镜进行宫内注射。有关手术设置和手术过程中使用的材料,请参阅图 3。静脉注射的详细协议可以在16其他地方找到。
- 通过注射木拉辛和氯胺酮(20毫克/千克和80毫克/千克)或其他特定机构动物护理和使用委员会批准的优选麻醉剂,麻醉小鼠。使用脚趾捏17确保麻醉的适当深度。
- 用苯肾上腺素 HCL 使小鼠学生进行分型 (2.5%)和硫酸阿托品 (1%)使静脉室具有良好的可见度,并在眼睛上涂抹润滑剂眼凝胶,使其在手术过程中保持水分。
- 用 26 G 针作为导孔刺穿边缘上的尖板,确保 1) 针与眼睛和桌子以 45° 角,2) 倾斜的尖端朝上,以避免刺穿镜头。
- 在目视检查下,使用连接到汉密尔顿注射器的 27 G 钝尖针小心地注射胶囊,在目视检查下,确保避免用针头接触镜头。镜头损伤会导致白内障的形成。使用解剖显微镜,胶囊应该在天分器中可见(图4A)。
- 收回针头后,除去塞米松眼科抗生素软膏外,还用抗生素软膏新霉素和多霉素B硫酸盐治疗注射部位。
- 应用 goniotaire hypromellose 脱乳乳液 (2.5%)两只眼睛,以防止角膜在恢复期间干燥。
- 将鼠标放在 37°C 的加热垫上,并监控直至完全唤醒。
- 成功注射封装的ARPE-19细胞,应揭示小鼠的白细胞室中存在完整的胶囊,当通过光学相干断层扫描或其他方法成像眼睛时,只有少量的碎片(图4B)。
- 注射的小鼠眼睛,经过几天的恢复后,由于手术,现在准备实验范式在手。
注:图3和图4分别描述了眼部胶囊的外科设置和记录。
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Representative Results
ARPE-19细胞是一种自发不朽的人类RPE细胞系,在将胶囊植入眼睛后,可以封装和长期生存。藻酸盐封装的工具如图1所示。在这项研究中,证明在藻酸盐封装后,通过明亮的场成像证实了藻酸盐胶囊中的细胞(图2A)。活死检测在胶囊内的细胞上进行,显示90%的封装后生存能力(图2B)。为了确保胶囊内细胞的长期生存能力,胶囊溶解在柠分酸钠中,然后重新镀层细胞(图2C)。在独立实验中确认稳定的转染ARPE-19细胞表达和分泌所需的生物制剂14,在确定安全封装细胞的参数后,为眼内注射生产了胶囊。
向小鼠眼睛注射静脉注射需要使用 27 G 钝尖针(内径 210 μm)和精确的输送系统,以持续注入所需的小体积 1 μL。通过27G针弹出期间未受损的胶囊大小通过显微镜证实(图2A)。确定了150μm的最佳尺寸。在目视检查下进行宫内注射,从而允许在维特里对胶囊进行可视化(图4A)。同样,OCT成像也进行了,这证实了小鼠的葡萄室中大多数胶囊完好无损,碎片量相对较小(图4B)。在后续发表的实验中,证实在治疗相关剂量下眼睛中存在所需的生物制剂,抑制了正在调查的疾病过程。这些结果证实,封装的细胞可以安全地注入小鼠的眼睛,用于生物制剂的长期输送。
图 1:封装过程仪器。该设置包括 (A) 3 mL 注射器, (B) 0.2 μm 过滤器, (C) 30 G, 1/2 英寸钝尖针, (D) 电子注射器驱动器, (E) 高压发电机, (F) 系统设置, 和 (G) 7 毫米固定距离之间的针尖和凝胶溶液表面.请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2:单元封装。(A) 充满 ARPE 19 细胞的微胶囊。(B) 活/死测定: [a] 红色荧光颜色表示死细胞,[b] 绿色荧光颜色表示活细胞。(C) 从微胶囊中恢复后培养细胞,从小簇开始生长到汇合。比例尺 = 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图3:手术设置。使用带有摄像机 (2) 的解剖显微镜 (1) 来可视化该过程。鼠标称重 (3) 以管理适量的麻醉剂,并放置在小平台上 (4) 以便于处理和注射。眼睛用肌化阿托品和苯甲苯肾上腺素(5)扩张,用润滑剂保持水分(6)。导孔使用 26 G 针 (7) 刺穿了边缘外。装有适当稀释胶囊(9)的玻璃注射器(8)以45°角放置在小鼠眼睛的45°角,并使用微操纵器(10)通过导孔推进。针轨以及释放的胶囊可以可视化[(11);参见图4[]。当针头回撤后,角膜被使用使用丙酮(12)和抗生素膏(13)涂湿到注射部位,以避免感染。手术后,鼠标将放置在37°C加热垫上,并监测到完全清醒。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4:封装的细胞技术,将ARPE-19送入眼睛。(A) 注射使用连接到汉密尔顿注射器的钝 27 G 针进行。当针尖进入眼睛时,可以跟踪针轨,避免镜头和胶囊(箭头)可以可视化,由鼠标眼的光学系统放大。需要注意的是光源的圆形反射。(B) 胶囊(箭头)可以使用光学相干断层扫描在光谱中成像。比例尺 = 200 μm. 面板 B 在 Annamalai 等人的许可下重印。Please click here to view a larger version of this figure.
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Discussion
这种细胞封装技术相对快速且易于执行;但是,必须牢记某些点,以获得准确的下游结果。细胞应在培养物中保存,然后封装,并适当保持汇合。如果可能,应在适当的通风罩中进行封装,并调节气流。气流太强会影响胶囊的形成,特别是在长期实验中。无菌器具和溶液对胶囊内细胞的长期维护至关重要。
目前,活死染色被用作确定胶囊内细胞生存能力的确认工具。每个胶囊的细胞数和当前条件下(即通常每个胶囊12-20个细胞)也目视地确定。此方法监视每批封装的单元批处理的可行性。为了进一步确定细胞的可行性,封装的细胞被溶解并重新培养。这进一步证明了胶囊内细胞的可行性和完整性,验证了成功的细胞封装。
用于细胞封装的参数已针对此特定单元类型建立了。上述参数是用于这些实验ARPE 19细胞封装的参数。胶囊的流速、藻酸盐浓度、施加的电压和二次涂层都是可调整以适应胶囊适当使用的变量。同样,给定实验所需的胶囊数量需要根据经验或基于生物制剂的已知PK/PD来确定。重要的是要总是执行适当的控制实验,添加空胶囊来控制胶囊的存在,胶囊和胶囊装载未转染的ARPE-19细胞,以控制秘密因子的存在。ARPE-19细胞也可以用对照质粒进行稳稳地转染,因为小鼠小葡萄(<10 μL)中甚至存在少量胶囊似乎改变了眼睛的正常生理。在此背景下,了解 APRE-19 细胞在封装条件下(以及在特定疾病条件下存在白细胞)的分泌体非常重要,因为分泌的蛋白质可能会干扰被调查的生物制剂的功效。
最后,该技术的实施为AMD治疗补充抑制剂的长期输送提供了原理证明,并改进了目前静脉注射的方法14。在目前的开发阶段,补充抑制剂被注射到葡萄,通常使用每月注射。这包括注射补充因子D阻断抗体兰巴利祖马布18,在三期临床试验中失败,以减少地理萎缩的进展,或补充因子3抑制剂APL-219,这是目前在第三阶段的临床试验。
注射本身的副作用(即视网膜分离的风险、眼内压力升高、宫内膜炎等)阻碍了宫内注射。此外,每月注射静脉注射后,药物水平将发生显著变化,并有望出现反弹反应。作为一种替代,基因治疗策略正在开发中,如可溶性CD59补充抑制剂20,目前处于I期临床试验阶段。封装的细胞还允许长期持续生产生物,如果需要,可以终止(即外植胶囊)。
到目前为止,我们只测试了在+6周14周内生产生物制剂。需要注意的是,此处描述的方法应仅用于动物模型中的原理证明,而不是用于患者,因为藻酸盐胶囊不够稳定,无法完全防止注射过程中切碎,预计不会持续数周以上。相比之下,像Neurotech开发的固体设备可以持续21年,以提供所需的因素22,23,24。22,23,24此外,这种新技术也可以与封装药物输送相结合。总体而言,预计这一新兴领域将迅速发展,作为反复注射基因治疗的替代策略。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的财务利益。
Acknowledgments
这项研究部分得到了国家卫生研究院(R01EY019320)、退伍军人事务部(RX000444和BX003050)和南卡罗来纳州智能国家基金会授予B.R.的赠款的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 mL Syringe | BD | 309656 | |
30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
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