الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية
Summary
تتعاون بروتينات Cognate J-domain مع مرافق Hsp70 للمساعدة في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين طي البروتين إلى التدهور. هنا، ونحن نصف دراسة الربط القرب في الموقع، والذي يسمح برصد هذه الآلات مرافقة شكلت عابرة في الخلايا البكتيرية والخميرة والبشرية.
Abstract
البروتينات J-المجال (JDPs) تشكل أكبر وأكثر تنوعا الأسرة المشتركة في الخلايا eukaryotic. وتظهر النتائج الأخيرة أن أعضاء معينين من عائلة JDP يمكن أن تشكل المجمعات غير المتجانسة العابرة في eukaryotes لضبط اختيار الركيزة لضبط البروتين صدمة الحرارة 70 kDa (Hsp70) المثبطون القائم على البروتين المفككة. تستهدف مجمعات JDP البروتينات المجمعة الناجمة عن الإجهاد الحاد/المزمن، ويفترض أنها تساعد في تجميع التدرجات عن طريق توظيف عدة من Hsp70s على سطح مجاميع البروتين. مدى شبكة مراقبة جودة البروتين (PQC) التي شكلتها هذه JDPs التفاعل جسديا لا يزال إلى حد كبير غير مميزة في الجسم الحي. هنا، نقوم بوصف الفحص المجهري القائم على التفاعل البروتيني في الموقع المسمى الفحص ربط القرب (PLA)، والتي هي قادرة على التقاط بقوة هذه المجمعات مرافقة شكلت عابرة في مقصورات الخلوية متميزة من الخلايا eukaryotic. عملنا يوسع توظيف جيش التحرير الشعبى الصينى من الخلايا البشرية إلى الخميرة(Saccharomyces cerevisiae)والبكتيريا (الإشريكيةالقولونية) ، مما يجعل أداة هامة لرصد ديناميات جمعيات البروتين شكلت بشكل عابر في كل من الخلايا البروكاريوتيكية وeukaryotic.
Introduction
كمية هائلة من المعلومات الجينية لا تزال غير قابلة للتفسير بسبب فهمنا غير الكامل للinteractomes الخلوية. إن منهجيات الكشف عن التفاعل التقليدي بين البروتين والبروتين، مثل الهطول المناعي المشترك للبروتين مع/بدون الربط بين المواد الكيميائية وتوطين البروتين المشترك، على الرغم من استخدامه على نطاق واسع، تشكل مجموعة من العيوب. وتشمل بعض المساوئ الرئيسية ضعف التحديد الكمي للتفاعلات وإمكانية إدخال أحداث ملزمة غير أصلية. وبالمقارنة، توفر التقنيات الناشئة القائمة على القرب نهجاً بديلاً وقوياً لالتقاط تفاعلات البروتين في الخلايا. اختبار الربط القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى)1، والمتاحة الآن كمجموعة الملكية ، ويستخدم الأجسام المضادة لاستهداف على وجه التحديد مجمعات البروتين على أساس القرب من الوحدات الفرعية المتفاعلة.
بدأ جيش التحرير الشعبى الصينى من خلال تشكيل سقالة تتكون من الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع علامات الحمض النووي الصغيرة (تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى) على سطح مجمع البروتين المستهدف (الشكل 1، الخطوات 1-3). بعد ذلك، التي يحددها القرب من علامات الحمض النووي، يتم إنشاء جزيء الحمض النوويالدائري عن طريق التهجين مع موصل oligonucleotides (الشكل 1، الخطوة 4). يتم الانتهاء من تشكيل الحمض النووي الدائري عن طريق خطوة ربط الحمض النووي. القطعة الدائرية التي تم تشكيلها حديثا من الحمض النووي بمثابة قالب لتضخيم دائرة المتداول اللاحقة (RCA) القائم على تفاعل سلسلة بوليميراز (PCR) تستعد من قبل واحدة من العلامات oligonucleotide المترافقة. وهذا يولد جزيء الحمض النووي المقعر الذي تقطعت به السبل واحد تعلقعلى مجمع البروتين عن طريق سقالة الأجسام المضادة (الشكل 1، الخطوة 6). يتم تصور جزيء الحمض النووي المتسلسل باستخدام oligonucleotides المسمى بشكل فلورسنت التي تهجينإلى تسلسل فريد ة متعددة متناثرة عبر الحمض النووي تضخيم (الشكل 1، الخطوة 7)2. تتوافق إشارة PLA التي تم إنشاؤها، والتي تظهر كنقطة فلورسنت (الشكل1، الخطوة 7)، مع موقع مجمع البروتين المستهدف في الخلية. ونتيجة لذلك، يمكن للتحليل الكشف عن مجمعات البروتين بدقة مكانية عالية. هذه التقنية لا تقتصر على مجرد التقاط تفاعلات البروتين، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن جزيئات واحدة أو تعديلات البروتين على البروتينات ذات الحساسية العالية1،2.
Hsp70 يشكل نظام مرافق ة متعدد الاستخدامات للغاية مهم بشكل أساسي للحفاظ على التوازن البروتين الخلوي من خلال المشاركة في مجموعة من التدبير المنزلي والوظائف المرتبطة بالإجهاد. وتشمل أنشطة التدبير المنزلي لنظام مرافقة Hsp70 دي نوفو طي البروتين، ونقل البروتين عبر الأغشية الخلوية، وتجميع وتفكيك مجمعات البروتين، وتنظيم نشاط البروتين وربط مختلف البروتين للطي / آلات مراقبةالجودة 3. نفس نظام الchaperone أيضا refolds misfolded /unfolded البروتينات، ويمنع تجميع البروتين، ويعزز تصنيف البروتين ويتعاون مع البروتياز الخلوية لتحلل البروتينات التي لا نهاية لها مطوية / التالفة لتسهيل إصلاح الخلوية بعد بروتيوسالاجهاد4,5. ولتحقيق هذا التنوع الوظيفي، يعتمد مرافق Hsp70 على الشراكة المشتركة بين الشركاء في عائلة JDP وعوامل التبادل النيوكليوتيد (NEFs) التي تقوم بصقل التحكم في اللوستريك المعتمد على ATP 70 من ربط الركيزة والإصدار3، 6. وعلاوة على ذلك، فإن المشاركين في مرافقة JDP تلعب دورا حيويا في اختيار ركائز لهذا النظام مرافقة تنوعا. وينقسم أفراد هذه الأسرة إلى ثلاث فئات (A و B و C) على أساس الهولوجية الهيكلية الخاصة بهم إلى النموذج الأولي JDP، E. coli DnaJ. الفئة A JDPs تحتوي على N-محطة J-المجال، الذي يتفاعل مع Hsp70، وهي منطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، وهي منطقة ملزمة الركيزة تتكون من منطقة تشبه أصابع الزنك (ZFLR) واثنين من المجالات بيتا برميل، ومجال ديميريسي محطة C. JDPs مع N-محطة J-المجال ومنطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، ولكن تفتقر إلى ZFLR، تقع في الفئة B. وبصفة عامة، يشارك أفراد هاتين الفئتين في مهام مرافقة. الأعضاء الذين يندرجون تحت الفئة C، والتي تحتوي على JDPs التي تشترك فقط في J-المجال4، تجنيد Hsp70s لأداء مجموعة متنوعة من وظائف غير مرافقة. وينعكس الدور الهام للJDPs كـ “محولات” قابلة للتبديل في نظام Hsp70 من خلال توسع أفراد الأسرة أثناء التطور. على سبيل المثال، البشر لديهم أكثر من 42 أعضاء JDP متميزة4. هذه JDPs تعمل كمونومرات، homodimers و / أو homo/hetero oligomers4،5. في الآونة الأخيرة، تعاون وظيفي عن طريق تشكيل معقدة عابرة بين الفئة ألف (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJA2؛ S. cerevisiae Ydj1) والفئة B (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) تم الإبلاغ عن JDPs eukaryotic لتعزيز الاعتراف الفعال لمجاميع البروتين غير متبلور في المختبر7،8. هذه المجمعات JDP فئة مختلطة يفترض تجميع على سطح البروتينات المجمعة لتسهيل تشكيل Hsp70- و Hsp70 + Hsp100 القائم على البروتين disaggregases7،8،9، 10.تم توفير الأدلة الحاسمة لدعم وجود هذه المجمعات من فئة مختلطة شكلت عابرة JDP في الخلايا eukaryotic مع جيش التحرير الشعبى الصينى8.
ويستخدم جيش التحرير الشعبي بشكل متزايد لتقييم تفاعلات البروتين في ميتازوا، في المقام الأول في خلايا الثدييات. هنا، نبلغ عن التوسع الناجح لهذه التقنية لرصد المجمعات مرافقة شكلت عابرة في الكائنات أحادية الخلية eukaryotic وprokaryotic مثل الخميرة الناشئة S. سيريفيسياي والبكتيريا E. القولونية. والأهم من ذلك، يسلط هذا التوسع الضوء على الاستخدام المحتمل لجيش التحرير الشعبي في الكشف عن الميكروبات التي تصيب الخلايا البشرية والحيوانية وتحليلها.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت النُهُج القائمة على التسيب المناعي المشترك والتوطين المشترك كأساليب طويلة الأمد لتوصيف تجميع البروتين. ويشكل الكشف عن مجمعات مرافقة محددة مشكلة بصورة عابرة تحديا رئيسيا بهذه الأساليب التقليدية، ونتيجة لذلك، فإن النتائج السابقة تقتصر إلى حد كبير على التفسيرات النوعية. غالبا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتلقى البرنامج دعما من منحة توظيف خاصة من كلية الطب في جامعة موناش للتمريض والعلوم الصحية بتمويل من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. نشكر بيرند بوكو (ZMBH، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) وهارم ه. كامبينجا (قسم العلوم الطبية الحيوية للخلايا والنظم، جامعة خرونينغين، هولندا) على دعمهما ومشاركة الكواشف التي لا تقدر بثمن، هولغر لورنز (ZMBH) مرفق التصوير، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) لدعمه في الفحص المجهري البؤري ومعالجة الصور، وكلير هيرست (ARMI، جامعة موناش، أستراليا) للقراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
