細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング
Summary
コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。
Abstract
Jドメインタンパク質(JGP)は、真核細胞において最大かつ最も多様なコシャペロンファミリーを形成します。最近の知見は、JDPファミリーの特定のメンバーが真核生物の一過性ヘテロ複合体を形成し、70 kDaヒートショックタンパク質(Hsp70)シャペロンベースのタンパク質分解物の基質選択を微調整できることを示している。JDP複合体は、急性/慢性ストレス誘発凝集タンパク質を標的とし、タンパク質凝集体の表面に複数のHsp70sをリクルートすることにより、逆凝縮物を組み立てるのに役立つ可能性があります。これらの物理的に相互作用するJDPによって形成されるタンパク質品質管理(PQC)ネットワークの程度は、生体内ではほとんど特徴付けられていないままである。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)と名付けられたその中の顕微鏡ベースのタンパク質相互作用アッセイについて説明し、真核細胞の異なる細胞区画においてこれらの一時的に形成されたシャペロン錯体を強く捕捉することができる。我々の研究は、PLAの雇用をヒト細胞から酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(エシェリヒア・コリ)に拡大し、両方で一過性に形成されたタンパク質アセンブリのダイナミクスを監視する重要なツールを提供する。原核生物および真核細胞。
Introduction
膨大な量のゲノム情報は、細胞相互作用の我々の不完全な理解のために解釈できないままである。従来のタンパク質とタンパク質の相互作用検出方法は、化学的架橋およびタンパク質の共局在化を伴うタンパク質共免疫沈殿などの方法論であるが、広く使用されているが、様々な欠点を提起する。主な欠点のいくつかは、相互作用の定量化が不十分であり、非ネイティブ結合イベントの潜在的な導入が含まれます。これに対し、新しい近接ベースの技術は、細胞内のタンパク質相互作用を捕捉するための代替的かつ強力なアプローチを提供します。近接ライゲーションアッセイ(PLA)1は、現在独自のキットとして利用可能であり、相互作用するサブユニットの近接性に基づいてタンパク質複合体を特異的に標的とする抗体を採用している。
PLAは、標的タンパク質複合体の表面に小さなDNAタグ(PLAプローブ)を持つ一次および二次抗体からなる足場の形成によって開始される(図1、ステップ1-3)。次に、DNAタグの近接性によって決定され、コネクタオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して円形DNA分子が生成される(図1、ステップ4)。円形DNAの形成は、DNAライゲーション工程によって完了する。新たに形成されたDNAの円形片は、共役オリゴヌクレオチドタグの1つによってプライミングされた後続の転がり円増幅(RCA)ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして機能する。これにより、抗体足場を介してタンパク質複合体に付着した一本鎖連結DNA分子が生成される(図1、ステップ6)。連結DNA分子は、増幅されたDNAに散在する複数のユニークな配列にハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて可視化される(図1、ステップ7)2)生成されたPLAシグナルは、蛍光ドット(図1、ステップ7)として現れ、細胞内の標的タンパク質複合体の位置に対応する。その結果、アッセイは高い空間精度でタンパク質複合体を検出することができました。この技術は、単にタンパク質相互作用を捕捉するだけではなく、高感度1、2のタンパク質上の単一分子またはタンパク質修飾を検出するためにも利用することができる。
Hsp70は、ハウスキーピングおよびストレス関連機能の配列に参加することにより、細胞タンパク質恒常性を維持するために根本的に重要な非常に汎用性の高いシャペロンシステムを形成する。Hsp70シャペロンシステムのハウスキーピング活動には、デノボタンパク質折りたたみ、細胞膜間のタンパク質転移、タンパク質複合体の組み立ておよび分解、タンパク質活性の調節および異なるタンパク質折りたたみ/リンクが含まれます。品質管理機械3.同じシャペロンシステムはまた、誤った折り畳み/展開されたタンパク質を折りたたみ、タンパク質凝集を防止し、タンパク質の分解を促進し、細胞プロテアーゼと協力して、末端に誤った折り畳み/損傷を受けたタンパク質を分解し、細胞修復を容易にします。プロテオトキシックストレス4,5.この機能的多様性を達成するために、Hsp70シャペロンは、Hsp70のATP依存性アロステリック制御を微調整するJDPファミリーとヌクレオチド交換因子(NEF)のパートナーシップコシャペロンに依存し、基質結合および放出3、 6.さらに、JDPコシャペロンは、この汎用性の高いシャペロンシステムの基板選定において重要な役割を果たします。このファミリーのメンバーは、プロトタイプJDP、大腸菌DnaJに対する構造相同性に基づいて3つのクラス(A、BおよびC)に細分化される。クラスA JGPは、Hsp70と相互作用するN末端Jドメイン、グリシンフェニルアラニン豊富な領域、亜鉛指様領域(ZFLR)と2つのβバレルドメインからなる基質結合領域、およびC末端二量化ドメインを含む。N末端Jドメインおよびグリシンフェニルアラニンが豊富な領域を有するJGPは、ZFLRを欠いているが、クラスBに分類される。一般に、これら 2 つのクラスのメンバは、チャペロン関数に関与しています。Jドメイン4のみを共有するJGPを含むキャッチオールクラスCに該当するメンバーは、Hsp70sを募集して様々な非チャペロン機能を実行します。Hsp70システムの交換可能な基板認識「アダプター」としてのJDPの重要な役割は、進化中の家族の拡大によって反映される。たとえば、人間には 42 を超える異なる JDP メンバー4があります。これらのJDFは、モノマー、ホモダイマーおよび/またはホモ/ヘテロオリゴマー4、5として機能します。近年、クラスA間の一過性複合体形成による機能的協力(例えば、H.サピエンスDNAJA2;S. セレビシエYdj1) とクラス B (例えば, H.サピエンスDNAJB1;S.セレビシエSis1)真核生物JDPは、インビトロ7,8における非晶質タンパク質凝集体の効率的な認識を促進することが報告された。これらの混合クラスJDP複合体は、おそらくHsp70-およびHsp70+Hsp100ベースのタンパク質分解ガス7、8、9の形成を容易にするために凝集タンパク質の表面に集合する10.真核細胞におけるこれらの一過性形成混合クラスJDP複合体の存在を支持する重要な証拠をPLA8で提供した。
PLAは、主に哺乳動物細胞におけるメタゾアにおけるタンパク質相互作用の評価にますます採用されています。ここでは、真核生物および原核生物単細胞生物(発芽酵母S.セレビシエおよび細菌大腸菌)において一過性に形成されたシャペロン複合体をモニタリングするこの技術の拡大に成功したと報告する。重要なことに、この拡張は、ヒトおよび動物細胞に感染する微生物を検出および分析する際のPLAの潜在的な使用を強調している。
Protocol
Representative Results
Discussion
共免疫沈殿および共局在化ベースのアプローチは、タンパク質集合を特徴付ける長年の方法として使用されてきた。一過性に形成された特定のシャペロン錯体の検出は、このような従来の方法では大きな課題であり、その結果、以前の所見は主に定性的解釈に限定される。細胞リシスベースの共免疫沈殿技術は、多くの場合、タンパク質とタンパク質の相互作用を安定させるために架橋を必?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NBNは、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの資金援助を受けて、モナッシュ大学医学部の特別募集助成金によって支援されています。ベルント・ブカウ(ZMBH、ハイデルベルク大学、ドイツ)とハーム・H・カンピングガ(オランダ・フローニンゲン大学生物医学科)の貴重な支援と試薬の共有に感謝します。イメージング施設、ハイデルベルク大学、ドイツ)は、共焦点顕微鏡と画像処理をサポートし、原稿の批判的な読み取りのためのクレア・ハースト(ARMI、モナッシュ大学、オーストラリア)。
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
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