Cognate J-Domain proteiner samarbetar med Hsp70 förkläde för att hjälpa till i en myriad av biologiska processer som sträcker sig från proteinvikning till nedbrytning. Här beskriver vi en in situ närhet ligering assay, som gör det möjligt att övervaka dessa transitivt bildade förkläde maskiner i bakteriell, jäst och mänskliga celler.
J-Domain proteiner (JDPs) utgör den största och mest varierande Co-Chaperone familjen i eukaryotiska celler. De senaste rönen visar att specifika medlemmar av JDP-familjen kan bilda transienta heterokomplex hos Eukaryoter för att finjustera substrat valet för 70 kDa-värmechockprotein (HSP70) chaperonbaserat protein disaggregas. Den JDP komplex mål akut/kronisk stress inducerade aggregerade proteiner och förmodligen hjälpa till att montera disaggregas genom att rekrytera flera Hsp70s till ytan av protein aggregat. Omfattningen av den protein Quality Control (PQC) nätverk som bildas av dessa fysiskt samverkande JDPs fortfarande i stort sett okarakteriserad in vivo. Här beskriver vi en mikroskopi-baserad in situ protein interaktionsanalys som heter Proximity ligering assay (PLA), som kan kraftfullt fånga dessa transitivt bildade förkläde komplex i olika cellulära avdelningar av eukaryota celler. Vårt arbete utökar sysselsättningen av PLA från mänskliga celler till jäst (Saccharomyces cerevisiae) och bakterier (Escherichia coli), vilket gör ett viktigt verktyg för att övervaka dynamiken i transitivt bildade protein sammansättningar i både prokaryotika och eukaryotiska celler.
En stor mängd genomisk information förblir oöversättliga på grund av vår ofullständiga förståelse av cellulära interactomes. Konventionella protein-protein interaktion detektionsmetoder såsom protein Co-immunoprecipitation med/utan kemisk tvärbindning och protein Co-lokalisering, men ofta används, utgör en rad nackdelar. Några av de största nackdelarna är dålig kvantifiering av interaktioner och potentiella införandet av icke-Native bindande händelser. I jämförelse, framväxande närhets-baserade tekniker ger ett alternativ och en kraftfull metod för att fånga proteininteraktioner i celler. Proximity ligering assay (PLA)1, som nu finns som ett egenutvecklat kit, använder antikroppar för att specifikt rikta proteinkomplex baserat på närheten av de samverkande subenheterna.
PLA initieras av bildandet av en byggnadsställning bestående av primära och sekundära antikroppar med små DNA-Taggar (PLA sonder) på ytan av det riktade protein komplexet (figur 1, steg 1-3). Nästa, bestäms av närheten av DNA-taggar, en cirkulär DNA-molekyl genereras via hybridisering med kontakt oligonukleotides (figur 1, steg 4). Bildandet av cirkulär DNA kompletteras av ett DNA ligeringsteg. Den nybildade cirkulära bit av DNA fungerar som en mall för den efterföljande rullande cirkel amplifiering (RCA)-baserade polymeras kedjereaktion (PCR) Primas av en av de konjugerade oligonukleotide taggar. Detta genererar en enkelsträngad concatemeric DNA-molekyl fäst vid protein komplexet via antikropps ställningen (figur 1, steg 6). Den concatemeric DNA-molekylen visualiseras med hjälp av fluorescerande märkta oligonukleotides som hybridiserar till flera unika sekvenser spridda över det förstärkta DNA (figur 1, steg 7)2. Den genererade PLA-signalen, som visas som en fluorescerande punkt (figur 1, steg 7), motsvarar placeringen av det riktade protein komplexet i cellen. Som ett resultat, analysen kunde upptäcka proteinkomplex med hög spatial noggrannhet. Tekniken är inte begränsad till att helt enkelt fånga proteininteraktioner, men kan också utnyttjas för att upptäcka enstaka molekyler eller proteinmodifieringar på proteiner med hög känslighet1,2.
Hsp70 bildar en mycket mångsidig förkläde system fundamentalt viktigt för att upprätthålla cellulära protein homeostas genom att delta i en rad hushållning och stressrelaterade funktioner. Housekeeping aktiviteter av Hsp70 förkläde systemet inkluderar de Novo proteinvikning, protein flyttning över cellulära membran, montering och demontering av proteinkomplex, reglering av protein aktivitet och länka olika protein Folding/ kvalitetskontroll maskiner3. Samma förkläde systemet refolds också felvikt/vecklade proteiner, förhindrar protein aggregation, främjar protein uppdelning och samarbetar med cellulära proteaser för att försämra oboskt missvecklade/skadade proteiner för att underlätta cellulära reparation efter proteotoxiska spänningar4,5. För att uppnå denna funktionella mångfald, den Hsp70 förkläde förlitar sig på samarbetar Co-Chaperones av JDP familjen och nukleotid utbyta faktorer (Nefs) att finjustera Hsp70’s ATP-beroende Alloster kontroll av substrat bindning och release3, 6. Vidare, JDP Co-Chaperones spela en viktig roll i valet av substrat för denna mångsidiga förkläde systemet. Medlemmarna i denna familj är indelade i tre klasser (A, B och C) baserat på deras strukturella homologi till prototypen JDP, E. coli dnaj. Klass A JDPs innehåller en N-Terminal J-domän, som samverkar med Hsp70, en glycin-fenylalanin rik region, ett substrat bindande region bestående av en zink finger-liknande region (ZFLR) och två β-Barrel domäner, och en C-Terminal Dimerization domän. JDPs med en N-Terminal J-domän och en glycin-fenylalanin rik region, men saknar ZFLR, falla i klass B. I allmänhet är medlemmar i dessa två klasser inblandade i chaperoning funktioner. Medlemmar som omfattas av catchall klass C, som innehåller JDPs att endast dela J-domän4, rekrytera Hsp70s att utföra en mängd icke-chaperoning funktioner. Den viktiga roll JDPs som utbytbara substrat erkännande “adaptrar” av Hsp70 systemet återspeglas av en utvidgning av familjemedlemmar under evolutionen. Till exempel har människor över 42 distinkta JDP medlemmar4. Dessa jdps fungerar som monomerer, homodimers och/eller homo/hetero oligomerer4,5. Nyligen, ett funktionellt samarbete via övergående komplex formation mellan klass A (t. ex., H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) och klass B (t. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotisk jdps rapporterades att främja ett effektivt erkännande av amorfa protein aggregat in vitro-7,8. Dessa blandade klass JDP komplex förmodligen samlas på ytan av aggregerade proteiner för att underlätta bildandet av Hsp70-och Hsp70 + Hsp100-baserade protein disaggregas7,8,9, 10. den kritiska bevisningen för att stödja förekomsten av dessa transitivt bildade blandad klass JDP-komplex i eukaryota celler TILLHANDAHÖLLS med PLA8.
PLA är alltmer anställd för att bedöma proteininteraktioner i Metazoa, främst i däggdjursceller. Här rapporterar vi en lyckad expansion av denna teknik för att övervaka transitivt bildade förkläde komplex i eukaryota och prokaryota encelliga organismer som spirande jäst S. cerevisiae och bakterien E. coli. Viktigt, denna expansion belyser den potentiella användningen av PLA att upptäcka och analysera mikrober som infekterar mänskliga och animaliska celler.
Co-immunoprecipitation och co-lokalisering baserade metoder har använts som långvariga metoder för att karakterisera protein assembler. Upptäckten av transitivt bildade specifika förkläde komplex är en stor utmaning med sådana konventionella metoder, och som ett resultat, tidigare fynd är till stor del begränsad till kvalitativa tolkningar. Den cell lysis-baserade Co-immunoprecipitation tekniker kräver ofta cross-linking att stabilisera protein-protein interaktioner. Cell Lys ökar risken för att störa tran…
The authors have nothing to disclose.
NBN stöds av ett särskilt rekryterings bidrag från Monash University medicinska omvårdnad och hälsovetenskaper med finansiering från delstatsregeringen i Victoria och den australiska regeringen. Vi tackar Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg University, Tyskland) och harm H. Kampinga (Institutionen för biomedicinsk vetenskap av celler & Systems, University of Groningen, Nederländerna) för deras ovärderliga stöd och utbyte av reagenser, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelbergs universitet, Tyskland) för sitt stöd med konfokalmikroskopi och bildbehandling, och Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) för kritisk läsning av manuskriptet.
37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
anti-DnaK antibody | In house | ||
anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
anti-YFP antibody | In house | ||
Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
Triton-X100 | Merck | 108643 | |
Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |