Muis prostaat organoïden vertegenwoordigen een veelbelovende context voor het evalueren van mechanismen die differentiatie reguleren. Dit artikel beschrijft een verbeterde aanpak om prostaat organoïden vast te stellen, en introduceert methoden om (1) eiwit lysaat van organoïden te verzamelen, en (2) de organoïden voor de confocale microscopie van de hele Mount te fixeren en te vlechten.
Het prostaat epitheel bestaat overwegend uit basale en Luminale cellen. In vivo Lineage tracing is gebruikt voor het definiëren van de differentiatie capaciteit van de muis prostaat basale en Luminale cellen tijdens de ontwikkeling, weefsel-regeneratie en transformatie. Echter, het evalueren van cel-intrinsieke en extrinsieke regulatoren van de capaciteit van de prostaat epitheliale differentiatie met behulp van een lineage tracing aanpak vaak vereist uitgebreide fokken en kan kosten-prohibitief. In de prostaat organoïde assay genereren basale en Luminale cellen prostatisch epitheel ex vivo. Belangrijk is dat primaire epitheelcellen kunnen worden geïsoleerd van muizen van elke genetische achtergrond of muizen behandeld met een willekeurig aantal kleine moleculen voorafgaand aan, of na, plating in driedimensionale (3D) cultuur. Er wordt na 7-10 dagen voldoende materiaal voor de evaluatie van de differentiatie capaciteit gegenereerd. Verzameling van basaal afgeleide en Luminale afgeleide organoïden voor (1) eiwitanalyse door Western Blot en (2) immunohistochemische analyse van intacte organoïden door gehele confocale microscopie van de hele Mount stelt onderzoekers in staat de ex vivo-differentiatie te evalueren capaciteit van prostaat epitheelcellen. Bij gebruik in combinatie bieden deze twee benaderingen aanvullende informatie over de differentiatie capaciteit van prostaat basale en Luminale cellen in reactie op genetische of farmacologische manipulatie.
Basale en Luminale cellen bestaan uit de meerderheid van het prostaat epitheel1. Lineage tracing studies hebben uitgewezen dat deze celtypen overwegend zelfvolgehouden zijn door verschillende voor ouders in de Adult Mouse2; Luminale differentiatie van basale voor ouders is echter waargenomen in verschillende contexten, waaronder ontwikkeling3,4, weefselregeneratie5, ontsteking6,7 en prostaatkanker initiatie2,8. Bovendien ondersteunt opkomende data het bestaan van multipotente Luminale voor ouders en luminal-geëngageerde voorlopercellen9. Bij gemetastaseerde prostaatkanker vormt de differentiatie van een AR-afhankelijke Luminale afstamming tot een AR-onverschillig Lineage met basale en neuro-endocriene kenmerken een steeds waardelijker mechanisme van resistentie tegen androgeen pathway remmers10,11,12. Daarom, als differentiatie is betrokken bij normale fysiologie, kanker initiatie en resistentie tegen therapie, verhelderende belangrijke moleculaire regulatoren van prostaat epitheliale celdifferentiatie is van cruciaal belang.
De muis prostaat organoïde model is ontstaan als een elegante ex vivo context te bestuderen van de prostaat epitheel celdifferentiatie9,13,14. In deze test worden individuele epitheelcellen in een 3D-matrix verguld, waar ze klierstructuren genereren die zowel basale als Luminale cellen bevatten binnen 1 week. Terwijl de bestaande benaderingen voor het plateren van cellen in de organoïde-cultuur kunnen worden gebruikt om efficiënt organogeniden te genereren, vereisen deze benaderingen verdere optimalisatie14. Opmerkelijke uitdagingen in verband met het kweken van prostaat organoïden zijn (1) met uitzondering van tweedimensionale (2D) kolonies die onder de Matrigel (matrix gel) van de analyse vormen, (2) het behoud van de integriteit van de matrix gel tijdens de veranderingen in de media, en (3) het nauwkeurig tellen van organoïden. Dit artikel schetst een aanpak voor het genereren van organoïden uit epitheelcellen geïsoleerd van muis prostaat. De beschreven aanpak omvat coating platen met poly (2-hydroxyethyl methacrylaat) (poly-HEMA) om het optreden van 2D-kolonies te voorkomen. Bovendien worden cellen in een matrix gelring geplateerd, in plaats van een matrix gelschijf, waardoor het veranderen van de media en het tellen van organoïden minder uitdagend is. Deze technieken stellen onderzoekers in staat om gemakkelijker te onderzoeken hoe genetische veranderingen of kleine moleculen die vóór of tijdens de organoïde vorming worden geïntroduceerd, belangrijke processen zoals differentiatie veranderen.
Het oogsten van prostaat organoïden voor Western Blot of immunohistochemische analyse door Whole-Mount confocale microscopie kan waardevol mechanistisch inzicht geven in differentiatie13, maar er ontbreken ook gevestigde protocollen om organoïden voor dergelijke technieken voor te bereiden. Dit manuscript beschrijft benaderingen voor de oogst van organoïden voor (1) inzameling van proteïne lysaat, of (2) fixatie en kleuring voor confocale microscopie. Belangrijk is dat de benadering beschreven voor de vaststelling en kleuring prostaat organoïden aanzienlijk verbeterd met betrekking tot de bestaande methoden. Hoewel deze afhankelijk zijn van het snijden van organoïden15, gebruikt de in dit manuscript beschreven methode intact organoïden, die helpen beschermen tegen organoïde schade tijdens monstervoorbereiding. Bij gebruik in combinatie kunnen Western Blot en confocale microscopie waardevol inzicht geven in de moleculaire regulatoren van differentiatie. Als alternatief kunnen deze benaderingen worden gebruikt om andere processen zoals ontwikkeling en transformatie te modelleren.
Prostaat epitheel celdifferentiatie is betrokken bij zowel normale prostaat biologie2,3,4,5,6,7 en ziekte biologie8,10,11,12; de Master regulators van dit proces blijven echter ongedefinieerd. Het identificeren van belangrijke regulatoren van prostaat epitheliale celdifferentiatie is deels moeilijk te wijten aan het ontbreken van een goed opgezette context om het te modelleren. Hoewel 2D-monolaag-cultuur kan worden gebruikt voor het modelleren van differentiatie11,12, slaagt deze context er niet in om de complexe prostaat microomgeving te recapituleren. Bovendien, in vivo contexten voor model differentiatie lenen zich niet voor mechanistische studies, omdat ze een uitdaging zijn om te manipuleren. Daarom is de identificatie van een gemakkelijk te manipuleren, maar toch fysiologisch relevante context, om differentiatie te bestuderen van cruciaal belang.
Het prostaat-organoïde model vertegenwoordigt een elegante ex vivo-context waarin wordt gerapporteerd dat de basale Luminale differentiatie optreedt. Methoden voor het vaststellen van prostaat organoïden zijn goed vastgesteld14; echter, verdere optimalisatie van deze methoden is noodzakelijk. Verder worden de benaderingen voor de oogst en het bereiden van prostaat organoïden voor analyse niet duidelijk beschreven. Dit artikel beschrijft een benadering van plaat prostaat epitheelcellen geïsoleerd van muis prostaat in organoïde cultuur. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om (1) het optreden van 2D-kolonies tijdens organoïde vorming te voorkomen, (2) het risico op verstoring van de matrix gel tijdens de media-aanvulling te verminderen en (3) de organoïden effectiever te tellen. Daarnaast schetst dit manuscript benaderingen voor de oogst van organoïden voor de voorbereiding van de analyse van Western Blot of de confocale microscopie van de hele berg. Belangrijk is dat de aanpak die wordt gebruikt voor het bereiden van organoïden voor confocale microscopie de intact-structuur van organoïden gedurende de looptijd handhaaft, wat organoïde schade vermindert voorafgaand aan beeld verwerving. In totaal breiden de beschreven benaderingen de capaciteiten van de prostaat organoïde test uit.
Met name kan de organoïde vormende capaciteit van basale en Luminale cellen worden gewijzigd, zowel door middel van methoden die worden gebruikt om de respectieve populaties te isoleren, als door cultuuromstandigheden. De organoïde cultuuromstandigheden die in deze test werden gebruikt, werden voor het eerst beschreven door karthaus et al.13. Overwegende dat Karthaus et al. hebben gemeld dat basale cellen een hogere organoïde vormende capaciteit hebben (15%) dan Luminale cellen (1%)13, Chua et al., met behulp van verschillende isolatie methoden en cultuuromstandigheden, hebben gemeld dat Luminale cellen (0,2-0,3%) hebben een hogere organoid-vormende capaciteit dan basale cellen (0,03%)20. In het algemeen leiden de door Karthaus et al. beschreven methoden tot hogere organoïdevorming voor zowel basale als Luminale cellen, die waarschijnlijk verschillen vertonen in de benadering die wordt gebruikt om basale en Luminale cellen13te isoleren, in tegenstelling tot cultuuromstandigheden die vooroordelen tegen organoïde vorming uit Luminale cellen. Het blijft onduidelijk of het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, de Luminale organoïde vorming van multipotente luminal-voorlopercellen bevordert, of toegewijd-luminal voor ouders9. Hoewel tijdige en kosten-prohibitieve, in vivo Lineage tracing studies kunnen worden gebruikt voor het valideren van de eigenschappen van de voorlopercellen in verband met verschillende prostaat epitheel kilometerstanden opgehelderd in de organoïde assay.
Processen zoals ontwikkeling, differentiatie en transformatie zijn niet alleen relevant voor de prostaat biologie, maar ook relevant voor de biologie van andere weefsels, waaronder de hersenen, longen, darmen, pancreas en lever. De beschreven methoden vergemakkelijken het gebruik van het organoïde model om deze processen te bestuderen in niet alleen de prostaat, maar ook een breed scala aan weefsels.
The authors have nothing to disclose.
PDC en JMG worden ondersteund door de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD wordt gesteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (R25GM055052) toegekend aan T. Hasson en de beurs Saul Martinez. ASG wordt ondersteund door het Spitzer Family Foundation Fund en de Gill Endowment. Dit werk werd gesteund door de American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), departement van defensie (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Early Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE bij prostaatkanker), Rose Hills Foundation en ondersteuning van het uitgebreide Kankercentrum van de UCLA Jonsson, het Broad stamcel onderzoekscentrum, het klinisch en translationeel wetenschaps Instituut en het Instituut voor urologische oncologie.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |