Mus prostata organoids representerer en lovende sammenheng for å evaluere mekanismer som regulerer differensiering. Dette papiret beskriver en forbedret tilnærming for å etablere prostata organoids, og introduserer metoder for å (1) samle protein lysat fra organoids, og (2) fikse og beis organoids for hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi.
Prostata epitel består hovedsakelig av basal og luminal celler. In vivo avstamning tracing har blitt benyttet for å definere differensiering kapasitet mus prostata basal og luminal celler under utvikling, vev-regenerering og transformasjon. Imidlertid, evaluering av celle-iboende og ytre regulatorer av prostata epitel differensiering kapasitet ved hjelp av en avstamning tracing tilnærming ofte krever omfattende avl og kan være kostnads uoverkommelige. I prostata organoid analysen, basal og luminal celler genererer prostata epitel ex vivo. Viktigere, kan primære epitelceller isoleres fra mus av genetisk bakgrunn eller mus behandlet med en rekke små molekyler før, eller etter, plating i tredimensjonale (3D) kultur. Tilstrekkelig materiale for evaluering av differensiering kapasitet er generert etter 7-10 dager. Innsamling av basal-avledet og luminal-avledet organoids for (1) proteinanalyse av Western Blot og (2) immunhistokjemiske analyse av intakt organoids av hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi gjør det mulig for forskere å evaluere ex vivo differensiering kapasitet av prostata epitelceller. Når den brukes i kombinasjon, disse to tilnærminger gir utfyllende informasjon om differensiering kapasitet av prostata basal og luminal celler som svar på genetisk eller farmakologisk manipulasjon.
Basal og luminal celler utgjør flertallet av prostata epitel1. Slekts sporing studier har avdekket at disse celletyper er overveiende selv-opprettholdes av distinkte forfedre i den voksne musen2; men luminal differensiering fra basal forfedre har blitt observert i flere sammenhenger, inkludert utvikling3,4, vevgjenfødelse 5,betennelse 6,7 og prostata kreft Initiation2,8. Videre støtter nye data eksistensen av Multipotent luminal forfedre så vel som luminal-begått forfedre9. I metastatisk prostatakreft, differensiering fra en AR-avhengige luminal avstamning til en AR-likegyldig avstamning med basal og Nevroendokrine funksjoner representerer en stadig mer verdsatt mekanisme motstand mot androgen Pathway hemmere10,11,12. Derfor, som differensiering er innblandet i normal fysiologi, kreft initiering og resistens mot terapi, Elucidating viktigste molekylære regulatorer av prostata epitel celle differensiering er kritisk.
Musen prostata organoid modellen har dukket opp som en elegant ex vivo kontekst for å studere prostata epitel celle differensiering9,13,14. I denne analysen, individuelle epitelceller er belagt inn i en 3D-matrise der de genererer kjertel strukturer som inneholder både basal og luminal celler innen 1 uke. Mens eksisterende tilnærminger for plating celler i organoid kultur kan brukes til å effektivt generere organoids, disse tilnærmingene krever ytterligere optimalisering14. Bemerkelsesverdige utfordringene forbundet med dyrking prostata organoids inkluderer (1) unntatt to-dimensjonale (2D) kolonier som danner under Matrigel (Matrix gel) fra analyse, (2) opprettholde integriteten til matrisen gel under Media endringer, og (3) telle organoids nøyaktig. Dette papiret skisserer en tilnærming til å generere organoids fra epitelceller isolert fra mus prostata. Tilnærmingen beskrevet innebærer belegg plater med Poly (2-hydroxyethyl akrylat) (Poly-HEMA) for å hindre forekomsten av 2D kolonier. Videre er celler belagt i en matrise gel ring, snarere enn en matrise gel plate, noe som gjør endring av media og telling organoids mindre utfordrende. Disse teknikkene gjør det lettere for forskerne å undersøke hvordan genetiske endringer eller små molekyler som introduseres før, eller under, organoid formasjon endrer nøkkelprosesser som differensiering.
Høsting av prostata organoids for Western Blot eller immunhistokjemiske analyse av hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi kan gi verdifull mekanistisk innsikt i differensiering13, men godt etablerte protokoller for å forberede organoids for slike teknikker mangler. Dette manuskriptet beskriver tilnærminger for å høste organoids for (1) samling av protein lysat, eller (2) fiksering og farging for konfokalmikroskopi mikroskopi. Viktigere, tilnærmingen beskrevet for innfesting og farging prostata organoids er betydelig forbedret i forhold til eksisterende metoder. Selv om disse er avhengige av snitting organoids15, utnytter metoden som er beskrevet i dette manuskriptet intakt organoids, som bidrar til å beskytte mot organoid Kader under prøve forberedelser. Når den brukes i kombinasjon, kan Western Blot og konfokalmikroskopi mikroskopi gi verdifull innsikt i den molekylære regulatorer av differensiering. Alternativt kan disse tilnærmingene brukes til å modellere andre prosesser som utvikling og transformasjon.
Prostata epitel celle differensiering har vært innblandet i både normal prostata biologi2,3,4,5,6,7 og sykdom biologi8,10,11,12; imidlertid forblir Master regulatorer i denne prosessen udefinert. Identifisere sentrale regulatorer av prostata epitel celle differensiering har vært vanskelig delvis på grunn av fravær av veletablerte kontekster å modellere den. Mens 2D monolag kultur kan brukes til å modellere differensiering11,12, denne konteksten unnlater å recapitulate den komplekse prostata mikromiljøet. Videre, in vivo sammenhenger til modellen differensiering ikke egner seg til mekanistisk studier, som de er utfordrende å manipulere. Derfor er identifisering av en lett å manipulere, men fysiologisk-relevant sammenheng, for å studere differensiering kritisk.
Prostata organoid modell representerer en elegant ex vivo kontekst hvor basal å luminal differensiering rapporteres å forekomme. Metoder for å etablere prostata organoids er godt etablert14; Imidlertid er ytterligere optimalisering av disse metodene nødvendig. Videre tilnærminger for å høste og forberede prostata organoids for analyse er ikke klart beskrevet. Dette papiret beskriver en tilnærming til plate prostata epitelceller isolert fra mus prostata i organoid kultur. Denne tilnærmingen gjør forskerne til (1) hindre forekomsten av 2D kolonier under organoid formasjon, (2) redusere risikoen for avbrudd til matrisen gel under Media etterfylling, og (3) telle organoids mer effektivt. I tillegg skisserer dette manuskriptet tilnærminger for å høste organoids for forberedelse til Western Blot analyse, eller hel-Mount konfokalmikroskopi mikroskopi. Viktigere tilnærmingen benyttet for å forberede organoids for konfokalmikroskopi mikroskopi opprettholder intakt struktur av organoids gjennom sin varighet, noe som reduserer organoid Kader før bildet oppkjøpet. Alt i alt, tilnærminger beskrevet utvide egenskapene til prostata organoid analysen.
Spesielt kan organoid-forming kapasitet av basal og luminal celler endres både ved metoder som brukes til å isolere de respektive populasjoner, og av kultur forhold. De organoid kultur forholdene som ble brukt i denne analysen ble først beskrevet av Karthaus et al.13. Mens Karthaus et al. har rapportert at basal celler har en høyere organoid forming kapasitet (15%) enn luminal celler (1%)13, Chua et al., ved hjelp av distinkte isolasjons metoder og kultur forhold, har rapportert at luminal celler (0,2-0,3%) har en høyere organoid kapasitet enn basal celler (0,03%)20. Overall, metoder beskrevet av Karthaus et al. føre til høyere organoid-forming priser for både basal og luminal celler, sannsynligvis reflekterer forskjellene i tilnærmingen brukes til å isolere basal og luminal celler13, i motsetning til kultur forhold som bias mot organoid formasjon fra luminal celler. Det er fortsatt uklart om protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet favoriserer luminal organoid formasjon fra Multipotent luminal forfedre, eller begått-luminal forfedre9. Selv om rettidig og kostnads uoverkommelige, in vivo avstamning tracing studier kan brukes til å validere stamfar funksjoner forbundet med distinkte prostata epitel linjene belyst i organoid analysen.
Prosesser som utvikling, differensiering og transformasjon er ikke bare relevant for prostata biologi, men også relevant for biologi av andre vev, inkludert hjernen, lunge, tarm, bukspyttkjertel og lever. Metodene beskrevet tilrettelegge for utnyttelse av organoid modellen til å studere disse prosessene i ikke bare prostata, men også et bredt spekter av vev.
The authors have nothing to disclose.
PDC og JMG støttes av Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD er støttet av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (R25GM055052) tildelt T. Hasson og Saul Martinez Scholarship. ASG er støttet av Spitzer Family Foundation Fund og Gill legat. Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Early medisinsk forskning Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE i prostatakreft), Rose Hills Foundation, og støtte fra UCLA ‘ s Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, klinisk og translational Science Institute, og Institutt for Urologiske onkologi.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |