מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.
המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.
כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,3,4,5.
נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס מייצרים ATP כדי לנהוג בתגובות תאיים ולייצר את אבני הבניין הדרושות לסינתזה מקרומולקולה. מאז HSPCs יש מסה נמוכה מיטוכונדריאלי בהשוואה לתאים הבדיל6 והם מקיימים השקט בגומחות במח ארוי העצם, hspcs מסתמכים בעיקר על גליקוליזיס. ההפעלה של HSPCs משפר את חילוף החומרים היטוכונדריאלי שמוביל לאובדן השקט והכניסה הבאה שלהם לתוך מחזור התא. הפלסטיות המטבולית הזאת של hspcs מאפשר תחזוקה של בריכת hspc לאורך חיי מבוגרים6,7,8,9,10,11,12. לכן, זה קריטי לחקור את פעילויות חילוף החומרים שלהם, כגון שיעור צריכת החמצן (OCR; אינדקס של זירחון חמצוני) ואת שיעור חמצה מסירה (ECAR; אינדקס של גליקוליזיס) כדי לנתח את ההפעלה HSPC ואת מצב הבריאות. הן OCR ו-ECAR ניתן למדוד בו זמנית, בזמן אמת, באמצעות מנתח השטף החילוץ. עם זאת, השיטה הנוכחית דורשת מספר גדול של תאים וממוטבת עבור תאים מחסיד13. מאז HSPCs לא ניתן לבודד בכמויות גדולות מעכברים14, דורשים מיון כדי להשיג אוכלוסייה טהורה, הם תאים לא חסיד15, ואין אפשרות להיות מתורבת לילה מבלי להימנע בידול16, זה היה קשה למדוד את ה-OCR ואת ecar של hspcs. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות ללוות וידאו מבוססי הדרכות על איך למדוד נשימה מטבולית ו גליקוליזיס של כמה אלפי העצם מוריין מחמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs.
כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |