Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis
Summary
Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per studiare il comportamento fototattica larvale della Drosophila. In questo analisi, un punto luce viene generato come stimolazione della luce e il processo di prevenzione della luce larvale è registrato da un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa.
Abstract
Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. La fototassia larvale della Drosophila può essere usata come modello per studiare il comportamento di evitamento degli animali. Questo protocollo introduce un saggio spot per studiare il comportamento fototattico larvale. Il set-up sperimentale include due parti principali: un sistema di stimolazione visiva che genera la luce leggera e un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa che registra il processo di prevenzione della luce larvale. Questo analisi consente di tracciare il comportamento della larva prima di entrare, durante l’incontro e dopo aver lasciato il punto luce. I dettagli del movimento larvale, tra cui decelerazione, pausa, colata e tornitura della testa, possono essere catturati e analizzati utilizzando questo metodo.
Introduction
Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. Drosophila fototaxis larvaè è stato in fase di indagine, soprattutto negli ultimi 50 anni1,2,3,4,5,6,7 ,8. Negli ultimi anni, nonostante il fatto che 1) molti neuroni che mediano l’elusione della luce larvale sono stati identificati4,5,9,10,11,12 e 2) il connettoma completo del sistema visivo larvale alla risoluzione delle sinapsi è stato stabilito13, i meccanismi neurali alla base della fototaxis larvale rimangono in gran parte poco chiari.
Un certo numero di saggi comportamentali sono stati utilizzati nello studio fototassi larvali. Possono essere in gran parte divisi in due classi: una che coinvolge gradienti di luce spaziale e l’altra che coinvolge gradienti di luce temporale. Per i saggi di gradiente di luce spaziale, l’arena è divisa in un numero uguale di sezioni in chiaro e buio. L’arena può essere divisa in metà chiara e scura2,4 o quadranti chiari e scuri14,15, o può anche essere separato in quadrati luminosi e scuri alternativi come su una scacchiera7. Di solito, piastre di agar sono utilizzati per il saggio di gradiente di luce spaziale, ma tubi che sono divisi in sezioni chiare e scure alternate possono anche essere utilizzati10,14.
Nella versione precedente dei saggi, l’illuminazione leggera proviene generalmente da sotto le larve. Tuttavia, l’illuminazione nelle versioni più recenti ha origine in gran parte dall’alto, poiché gli occhi larvali (ad esempio, gli organi del Bolwig sensibili alle intensità di luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyngeal opaco con aperture verso l’intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l’intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l’intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalofario opaco con aperture verso l’intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalophariongeal opaco con aperture verso l’intensità della luce bassa o media16 la parte anteriore superiore. Questo rende le larve più sensibili alla luce dalle direzioni anteriori superiori rispetto al basso dietro le direzioni7. Per i saggi di sfumatura di luce temporale, l’intensità della luce è spazialmente uniforme nell’arena, ma l’intensità cambia nel tempo. Oltre alla luce temporale ad onde quadrate (cioè lampeggiante on/off o luce forte/debole3,7), la luce temporaneamente variabile che si conforma ad una rampa lineare di intensità viene utilizzata anche8 per misurare la sensibilità delle larve ad un temporaneamente cambiando lo stimolo leggero.
Un terzo tipo di analisi fototaxis è la navigazione direzionale del paesaggio leggero, che coinvolge l’illuminazione dall’alto con un angolo di 45s7. Prima del lavoro di Kane et al.7, solo parametri grossolani come il numero di larve nelle regioni chiare e scure, la frequenza di tornitura e la lunghezza del sentiero sono stati calcolati in analisi fototassis larvali. Dal lavoro di questo stesso gruppo, con l’analisi della registrazione video ad alta risoluzione temporale per fototassi larvali, la dinamica dettagliata del movimento larvale durante il phototaxis (cioè velocità istantanee di diverse parti del corpo larvale, direzione di direzione, angolo di tornitura e la corrispondente velocità angolare) sono stati analizzati7. Così, più dettagli del comportamento fototassi larva sono stati in grado di essere scoperti. In questi saggi, le larve sono testate in gruppi in modo che gli effetti di gruppo non siano esclusi.
Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per lo studio delle risposte comportamentali larve alla stimolazione della luce individuale. Il principale set-up sperimentale consiste in un sistema di stimolazione visiva e in un sistema di imaging a luce infrarossa. Nel sistema di stimolazione visiva, una sorgente luminosa a LED genera un punto luminoso rotondo di 2 cm di diametro su una piastra di agar, dove viene testata la larva. L’intensità della luce può essere regolata utilizzando un driver LED. Il sistema di imaging include una telecamera a infrarossi che cattura il comportamento della larva oltre a tre LED a infrarossi da 850 nm che forniscono illuminazione per la fotocamera. L’obiettivo della fotocamera è coperto da un filtro passa-banda di 850 nm per impedire che la luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva entri nella fotocamera, mentre la luce infrarossa può entrare nella fotocamera. Pertanto, l’interferenza della stimolazione visiva sull’imaging è prevenuta. In questo saggio, i dettagli comportamentali delle risposte veloci delle singole larve entro un periodo compreso prima, durante e dopo l’immissione della luce vengono registrati e analizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta il saggio light spot per testare la capacità delle larve di Drosophila di fuggire dalla luce. Questo analisi consente di tracciare il comportamento delle larve prima di entrare, durante l’incontro e dopo aver lasciato un punto luce. I dettagli del movimento larvale possono essere catturati e analizzati. L’anamante del punto luce è molto semplice e possiede una forte praticabilità. Il costo dell’intero dispositivo non è elevato. Nell’esperimento, la luce LED viene utilizzata come so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla fondazione di scienze naturali della Cina (31671074) e dai Fondi di Ricerca fondamentali per le Università Provinciali di zhejiang (2019X-X003-12).
Materials
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
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