Lett spot-basert analyse for analyse av Drosophila larvestadiet Phototaxis

Summary

Denne protokollen introduserer en lys-spot-analysen for å undersøke Drosophila larvestadiet phototactic oppførsel. I denne analysen, en lys flekk er generert som lys stimulering, og prosessen med larvestadiet lys unngåelse er registrert av en infrarød lys-basert Imaging system.

Abstract

Larvene av Drosophila melanogaster viser åpenbare lys-unngå atferd under foraging scenen. Drosophila larvestadiet phototaxis kan brukes som modell for å studere dyr unngåelse oppførsel. Denne protokollen introduserer en lys-spot-analysen for å undersøke larvestadiet phototactic oppførsel. Den eksperimentelle oppsett omfatter to hoveddeler: et visuelt stimulering system som genererer lys spot, og en infrarød lys-basert Imaging system som registrerer prosessen med larvestadiet lys unngåelse. Denne analysen tillater sporing av atferden til Larven før du går inn, under møter, og etter å ha forlatt lyspunktet. Detaljer om larvestadiet bevegelse inkludert retardasjon, pause, hode støping, og snu kan fanges opp og analyseres ved hjelp av denne metoden.

Introduction

Larvene av Drosophila melanogaster viser åpenbare lys-unngå atferd under foraging scenen. Drosophila larvestadiet phototaxis har vært under etterforskning, spesielt i de siste 50 år^{1,2,3,4,5,6,7 ,8}. I de senere årene, til tross for at 1) mange neurons formidling larvestadiet lys unngåelse har blitt identifisert^{4,5,9,10,11,12} og 2) den komplette connectome av larvestadiet visuelle system ved oppløsning av synapser har blitt etablert¹³, de nevrale mekanismer underliggende larvestadiet phototaxis fortsatt i stor grad uklart.

En rekke atferds analyser har blitt brukt i å studere larvestadiet phototaxis. De kan i stor grad deles inn i to klasser: en som involverer romlige lys graderinger og den andre involverer Temporal lys gradienter. For romlige lys graderings analyser er arenaen inndelt i like mange seksjoner i lys og mørke. Arenaen kan deles inn i lyse og mørke halvdeler^2,4 eller lyse og mørke kvadranter^14,15, eller kan også skilles i alternative lyse og mørke firkanter som på et sjakkbrett⁷. Vanligvis er agar plater brukes til romlig lys gradient analysen, men rør som er delt inn i alternative lys og mørke seksjoner kan også brukes^10,14.

I eldre versjon av analysene, lys belysning vanligvis stammer fra under larvene. Men belysning i nyere versjoner i stor grad stammer fra oven, siden larvestadiet øyne (f. eks, Bolwig organer som er følsomme for lavt eller middels lys intensitet¹⁶) finnes i ugjennomsiktig cephalopharyngeal skjelett med åpninger mot øvre front. Dette gjør Larvene mer følsomme for lys fra øvre front retninger enn fra nedenfor bak retninger⁷. For Temporal lys gradient analyser, er lys intensiteten romlig uniform i arenaen, men intensiteten endres over tid. I tillegg til Temporal Square Wave Light (dvs. blinkende på/av eller sterk/svakt lys^3,7), timelig varierende lys som er i samsvar med en lineær rampe i intensitet er også brukt⁸ for å måle følsomheten av larver til en timelig skiftende lys stimulans.

En tredje type phototaxis analysen er retningsbestemt lys scape navigasjon, som innebærer belysning ovenfra i en vinkel på 45 °⁷. Før arbeidet med Kane et al.⁷, bare grov parametre som antall larver i lyse og mørke regioner, frekvens av snu, og Trail lengde ble beregnet i larvestadiet phototaxis analyser. Siden arbeidet med denne samme gruppen, med analyse av høy Temporal oppløsning video rekord for larvestadiet phototaxis, detaljert dynamikk av larvestadiet bevegelse under phototaxis (dvs. Instant hastigheter av ulike deler av larvestadiet kroppen, retning retning, snu vinkel og tilsvarende vinkel hastighet) har blitt analysert⁷. Således, flere detaljene av larvestadiet phototaxis opptreden ha blitt dugelig å bli oppdaget. I disse analysene testes Larvene i grupper slik at gruppe effekter ikke utelukkes.

Denne protokollen introduserer en lys-spot-analysen for etterforskningen av larvestadiet atferdsmessige reaksjoner på individuell lys stimulering. Det viktigste eksperimentelle oppsettet består av et visuelt stimulerende system og infrarødt lysbasert bildesystem. I det visuelle stimulering systemet genererer en LED-lyskilde en rund 2 cm-diameter lys flekk på en agar plate, der Larven er testet. Lysstyrken kan justeres ved hjelp av en LED-driver. Bilde systemet inkluderer et infrarødt kamera som fanger opp oppførselen til Larven i tillegg til 3 850 NM infrarøde lysdioder som gir belysning for kameraet. Objektivet på kameraet er dekket av et 850 NM band-pass filter for å blokkere lys fra det visuelle stimulering systemet fra å komme inn i kameraet, mens det infrarøde lyset har lov til å gå inn i kameraet. Dermed forhindres interferens med visuell stimulering på bildebehandling. I denne analysen, den atferdsmessige detaljer om rask respons av individuelle larver innen en periode, inkludert før, under og etter inn i lyset er registrert og analysert.

Protocol

1. utarbeidelse av Drosophila larver Forbered standard medium bestående av kokt korn måltid (73 g), agar (5,6 g), Soyabønne måltid (10 g), gjær (17,3 g), sirup (76 mL) og vann (1000 mL). Hev alle fluer ved 25 ° c på standard medium i et rom med en 12 h/12 h lys/mørk syklus. 2. utarbeidelse av agar plater Forbered 1,0% agar løsning. Veie 3 g av agar i et 500 mL beger med en balanse, legg deretter til 300 mL destillert vann. Plasser et folie …

Representative Results

Ifølge protokollen, lys flekk analysen ble brukt til å undersøke lys unngåelse oppførsel av tredje skikkelsen Larven som ble reist ved 25 ° c på standard medium i et rom med en 12 h/12 h lys/mørk syklus. En enkel w1118 Larven ble testet ved hjelp av lyspunkt analysen ved 25,5 ° c. Den gjennomsnittlige lysstyrken til lyspunktet som ble generert av en 460 NM LED, var 0,59 μW/cm2. Hele prosessen med larvestadiet inn og ut av lys stedet ble spilt inn og analysert ved hjelp av SOS-pro…

Discussion

Denne protokollen presenterer lyspunkt analysen for å teste evnen til Drosophila larver å flykte fra lys. Denne analysen tillater sporing av atferden til larver før du går inn, under møter, og etter å ha forlatt en lys flekk. Detaljer om larvestadiet bevegelser kan fanges opp og analyseres. Lyset flekk analysen er meget enkel og besitte kraftig gjennomførbarhet. Kostnaden for hele enheten er ikke høy. I eksperimentet brukes LED-lys som lyskilde. Den kan erstattes med lyskilder av forskjellige bølgelengd…

Materials

850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%