Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila
Summary
Este protocolo introduce un ensayo de punto ligero para investigar el comportamiento fototáctico larvario de Drosophila. En este ensayo, se genera un punto de luz como estimulación de la luz, y el proceso de evitación de la luz larval es registrado por un sistema de imágenes basado en luz infrarroja.
Abstract
Las larvas de Drosophila melanogaster muestran un comportamiento evidente que evita la luz durante la etapa de forrajeo. Drosophila fototaxis larval se puede utilizar como modelo para estudiar el comportamiento de evitación animal. Este protocolo introduce un ensayo de punto de luz para investigar el comportamiento fototáctico larvario. La configuración experimental incluye dos partes principales: un sistema de estimulación visual que genera el punto de luz y un sistema de imágenes basado en luz infrarroja que registra el proceso de evitación de la luz larval. Este ensayo permite el seguimiento del comportamiento de la larva antes de entrar, durante el encuentro y después de salir del punto de luz. Los detalles del movimiento larvario, incluyendo la desaceleración, la pausa, la fundición de la cabeza y el torneado, se pueden capturar y analizar utilizando este método.
Introduction
Las larvas de Drosophila melanogaster muestran un comportamiento evidente que evita la luz durante la etapa de forrajeo. Drosophila larval phototaxis ha estado bajo investigación, especialmente en los últimos 50 años1,2,3,4,5,6,7 ,8. En los últimos años, a pesar de que 1) muchas neuronas que median la evitación de la luz larval han sido identificadas4,5,9,10,11,12 y 2) el conectomotor completo del sistema visual larvaria a la resolución de las sinapsis se ha establecido13, los mecanismos neuronales subyacentes a la fototaxis larvaria siguen siendo en gran medida poco claros.
Se han utilizado varios ensayos conductuales para estudiar la fototaxis larvarios. Se pueden dividir en gran medida en dos clases: una que involucra gradientes de luz espacial y la otra que implica gradientes de luz temporales. Para ensayos de gradiente de luz espacial, la arena se divide en el mismo número de secciones en luz y oscuridad. La arena se puede dividir en mitades claras y oscuras2,4 o cuadrantes claros y oscuros14,15, o incluso se puede separar en cuadrados alternativos de luz y oscuridad como en un tablero de ajedrez7. Por lo general, las placas de agar se utilizan para el ensayo de gradiente de luz espacial, pero los tubos que se dividen en secciones alternas de luz y oscuridad también se pueden utilizar10,14.
En la versión anterior de ensayos, la iluminación ligera generalmente se origina desde debajo de las larvas. Sin embargo, la iluminación en versiones más recientes se origina en gran medida desde arriba, ya que los ojos larvarios (por ejemplo, los órganos de Bolwig que son sensibles a intensidades de luz bajas o medias16)están contenidos en el esqueleto cefalofaríngeo opaco con aberturas hacia el frente superior. Esto hace que las larvas sean más sensibles a la luz desde las direcciones frontales superiores que desde abajo detrás de las direcciones7. Para los ensayos de gradiente de luz temporal, la intensidad de la luz es espacialmente uniforme en la arena, pero la intensidad cambia con el tiempo. Además de la luz de onda cuadrada temporal (es decir, luz intermitente encendida/apagada o fuerte/débil3,7), la luz que varía temporalmente que se ajusta a una rampa lineal en intensidad también se utiliza8 para medir la sensibilidad de las larvas a una temporalmente cambiante estímulo de la luz.
Un tercer tipo de ensayo de fototaxis es la navegación de paisaje de luz direccional, que implica la iluminación desde arriba en un ángulo de 45o7. Antes del trabajo de Kane et al.7, sólo se calcularon parámetros gruesos como el número de larvas en las regiones claras y oscuras, la frecuencia de giro y la longitud del sendero en ensayos de fototaxis larvarios. Desde el trabajo de este mismo grupo, con el análisis de registro de vídeo de alta resolución temporal para fototaxis larvarios, dinámica detallada del movimiento larvario durante la fototaxis (es decir, velocidades instantáneas de diferentes partes del cuerpo larvario, dirección de rumbo, ángulo de giro y la velocidad angular correspondiente) se han analizado7. Por lo tanto, más detalles del comportamiento de la fototaxis larval han sido capaces de ser descubiertos. En estos ensayos, las larvas se prueban en grupos para que no se excluyan los efectos de grupo.
Este protocolo introduce un ensayo de punto de luz para la investigación de las respuestas conductuales larvales a la estimulación lupita individual. La configuración experimental principal consiste en un sistema de estimulación visual y un sistema de imágenes basado en luz infrarroja. En el sistema de estimulación visual, una fuente de luz LED genera un punto de luz redondo de 2 cm de diámetro en una placa de agar, donde se prueba la larva. La intensidad de la luz se puede ajustar mediante un controlador LED. El sistema de imágenes incluye una cámara infrarroja que captura el comportamiento de la larva, además de tres LED infrarrojos de 850 nm que proporcionan iluminación para la cámara. La lente de la cámara está cubierta por un filtro de paso de banda de 850 nm para impedir que la luz del sistema de estimulación visual entre en la cámara, mientras que la luz infrarroja puede entrar en la cámara. Por lo tanto, se previene la interferencia de la estimulación visual en la toma de imágenes. En este ensayo, se registran y analizan los detalles de comportamiento de las respuestas rápidas de las larvas individuales dentro de un período que incluye antes, durante y después de entrar en la luz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta el ensayo de punto ligero para probar la capacidad de las larvas de Drosophila para escapar de la luz. Este ensayo permite el seguimiento del comportamiento de las larvas antes de entrar, durante el encuentro y después de salir de un punto de luz. Los detalles del movimiento larvario pueden ser capturados y analizados. El ensayo de punto de luz es muy simple y posee una fuerte practicidad. El costo de todo el dispositivo no es alto. En el experimento, la luz LED se utiliza como fuente de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la fundación de ciencias naturales de China (31671074) y los Fondos De Investigación Fundamental para las Universidades Provinciales de Zhejiang (2019XZZX003-12).
Materials
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
Riferimenti
- Grossfield, J. Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).
- Godoy-Herrera, R. C. L. D. The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation. Animal Behaviour. 37, (1989).
- Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions. Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends in Neurosciences. 35, (2012).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).
- Humberg, T. H., et al. Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues. Nature Communications. 9. 1260, (2018).
- Gong, Z., et al. Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference. Science. 330, (2010).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341, 1113 (2013).
- Zhao, W., et al. A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference. Nature Communications. 10, (2019).
- Gong, C., et al. A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance. Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).
- Larderet, I., et al. Organization of the Drosophila larval visual circuit. eLife. 6, (2017).
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. Journal of Neurogenetics. 10, (1995).
- Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921 (2010).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, e41642 (2012).
