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Biologia dello sviluppo

手受粉、顕微鏡、遺伝子解析を組み合わせたアプリコットにおける自己と相互の関係の決定

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

蛍光顕微鏡による自己適合性とPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせたアプリコット(プルヌスアルメニアカL.)品種の受粉要件を確立する方法論を提示する。

Abstract

酒さにおける自己非適合性は、主に多アレリック軌跡Sによって制御されるGametophytic自己非適合システム(GSI)によって決定される。アプリコットでは、重要な数の新しい品種が放出され、未知の受粉要件を持つ品種が増加しているため、自己および相互互換性関係の決定がますます重要になっています。ここでは、自己(in)の適合性を、手受粉法と顕微鏡による、PCR解析によるS-遺伝子型の同定と組み合わせた方法論を述べた。自己(in)適合性決定のために、各品種からのバルーンステージで花を現場に集め、実験室で手受粉し、固定し、蛍光顕微鏡下で花粉管の挙動を観察するためにアニリンブルーで染色した。品種間の非相溶性関係の確立のために、各品種からDNAを若葉から抽出し、S-アレスをPCRによって同定した。このアプローチは、非互換性グループを確立し、新しい果樹園の設計に適切な受粉者を選択し、繁殖プログラムで適切な親を選択するための貴重な情報を提供する品種間の非互換性関係を解明することができます。

Introduction

自己非適合性は、自己受粉を防ぎ、1を越えることを促進するために植物を開花させる戦略です。酒さでは、この機構は、主に多アレリック軌跡S22によって制御されるGametophytic自己非適合システム(GSI)によって決定される。この様式では、RNase遺伝子はS−sタイラー決定基であるRNase3をコードし3、一方、S−花粉決定基を決定するFボックスタンパク質は、SFB遺伝子4によって体系化される。自己非適合性相互作用は、排卵体5,6,6の受精を防止するスタイルに沿った花粉管の成長の阻害を通じて行われる。

アプリコットでは、品種の更新は、過去20年間で世界中で行われました7,,8.この重要な数の新しい品種の導入は、異なる公的および民間の繁殖プログラムから、未知の受粉要件を有するアプリコット品種の増加をもたらした8。

アプリコットの受粉要件を決定するために、さまざまな方法論が使用されてきました。この分野では、ケージの木や魅惑的な花の中で制御された花粉化によって自己(in)互換性が確立され、その後、果実セット99、10、11、1210,11,12の割合を記録することができる。また、半生体内の花の培養や蛍,光顕微鏡,8、13、14、15、16、1713,14,の下で花粉管挙動の分析によって実験室で制御された受粉が行われている。151617近年、PCR解析やシーケンシングなどの分子技術により、RNase遺伝子とSFB遺伝子18,19,の研究に基づく非相溶関係の特徴付けが可能となった。アプリコットでは、33個のS対立アレス(S1〜S S20、S S22〜S S30、S,52、S S53、S Sv、S Sx)が報告されている(S Sc)12、18、20、21、22、23、24。22,23,2412,18,2021,cこれまで、26の非適合群は、S-遺伝子,型8、9、17、25、26、279,17に従ってこの種で刺されています。,26,27825同じS-allelesSを持つ品種は相互に互換性がありませんが、少なくとも1つの異なるS-対立アレスを持つ品種は、異なる非互換性グループに割り当てられ、相互互換性があります。

アプリコット品種の受粉要件を定義するために、蛍光顕微鏡による自己適合性の決定とアプリコット品種におけるPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせた方法論を記述する。このアプローチは、非互換性グループを確立し、品種間の非互換性関係を解明することができます。

Protocol

1. 自己(in)互換性判定 畑の花を試す。気球段階で花を集める必要があります (図1A),アプリコット28のためのBBCHスケールのステージ58に対応し、不要な以前の受粉を避けるために. 実験室での自己受粉とクロス受粉 バルーンステージで花のアンサーを取り除き、実験室の温度で乾燥させるために紙の上に置?…

Representative Results

アプリコットの受粉研究は、麻酔の前日に風船の後期段階で花を使用する必要があります(図1A)。花の構造はほぼ成熟しているので、この段階は花粉とピスティルコレクションの両方にとって最も有利であると考えられていますが、アンサーの非難はまだ起こっていません。これは、閉じた花びらは外部花粉を運ぶ昆虫の到着を妨げるので、同じ花から花粉?…

Discussion

伝統的に、ほとんどの市販アプリコットヨーロッパの品種は、自己互換性のある36でした。それにもかかわらず、過去数十年の繁殖プログラムにおける親としての北米の自己適合性品種の使用は、未知の受粉要件77、8、378,37を持つ新しい自己互換性のない品種の増加をもたらした。したがって、アプリコ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、シエンシア大臣、イノベルシダーデス・イ・ウニバーシダーデス・ヨーロピアン地域開発基金、欧州連合(AGL2016-77267-R、AGL2015-74071-JIN)によって資金提供されました。インスティトゥート・ナシオナル・デ・インベスティガシオン・イ・テクノロジア・アグラリア・イ・アリメンタリア(RFP2015-00015-00,RTA2017-00003-00);ゴビエルノ・デ・アラゴン・ヨーロピアン・ソーシャル・ファンド、欧州連合(グルポ・コンソリダド・A12_17R)、フンダシオン・バイオディビジダード、アグロゼグロS.A.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
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Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
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