Bu protokol, beyin bağışı programı ve beyinlerin doğru karakterizasyonu yoluyla bireysel beyin yaşlanma yörüngelerini izlemek için bir yöntem açıklar. Beyin bağışçıları seri çok boyutlu değerlendirmeler de dahil olmak üzere uzun vadeli bir uzunlamasına çalışmada yer almaktadır. Protokol beyin işleme ve doğru bir tanı metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını içerir.
Sürekli yaşlanan bir popülasyonda nörodejeneratif bozuklukların görülme sıklığının artması beklenmektedir. Hastalık mekanizmalarının anlaşılması önleyici ve iyileştirici önlemler inanahtarıdır. Bunu başarabilmek için en etkili yol hastalıklı ve sağlıklı beyin dokusunun doğrudan incelenmesi yoluyla. Yazarlar, bir antemortem beyin bağışı programına kayıtlı bireyler tarafından bağışlanan kaliteli beyin dokusu elde etmek, işlemek, karakterize ve depolamak için bir protokol mevcut. Bağış programı, insanlara karşı yüz yüze empatik bir yaklaşım, birbirini tamamlayan klinik, biyolojik, sosyal ve yaşam tarzı bilgileri koleksiyonu ve normal yaşlanma ve bilişsel gerilemenin bireysel yörüngelerini izlemek için zaman içinde seri çok boyutlu değerlendirmeler içermektedir. Birçok nörolojik hastalık asimetrik olduğundan, beyin bankamız taze numuneleri dilimleme için benzersiz bir protokol sunar. Her iki yarımkürenin beyin bölümleri dönüşümlü olarak dondurulur (-80 °C’de) veya formalin ile sabitlenir; bir yarımkürede sabit bir dilim diğer yarımkürede donmuş bir karşılık gelir. Bu yaklaşımla, tüm dondurulmuş maddelerin tam bir histolojik karakterizasyonu elde edilebilir ve her iki yarımküreden histolojik olarak iyi tanımlanmış dokular üzerinde omik çalışmalar yapılabilir ve böylece nörodejeneratif hastalık mekanizmalarının daha eksiksiz bir değerlendirmesini yapabilirsiniz. Bu hastalıkların doğru ve kesin tanısı ancak klinik sendrom ile nöropatolojik değerlendirmenin birleştirilmesiyle elde edilebilir ve bu da patogenezin yorumlanması için gerekli önemli etiyolojik ipuçlarını ekler. Bu yöntem, yalnızca sınırlı bir coğrafi alanı kapsadığı için zaman alıcı, pahalı ve sınırlı olabilir. Sınırlamaları ne olursa olsun, sağladığı yüksek karakterizasyon derecesi ödüllendirici olabilir. Nihai hedefimiz ilk İtalyan Beyin Bankası’nı kurmak, tüm bunlar olurken nöropatolojik olarak doğrulanmış epidemiyolojik çalışmaların önemini vurgulamaktır.
WHO’ya göre, şu anda yaklaşık 50 milyon kişi demans hastası ve bu rakamın 2050 yılına kadar üçkatına çıkarılaması öngörülüyor. Alzheimer Hastalığı demans önemli nedenidir, serebrovasküler hastalık ve diğer yaşa bağlı nörodejeneratif bozukluklar izledi. DSA, 2017 yılında demans konusunda farkındalığı artırmak ve buna karşı küresel bir eylem planını teşvik etmek için Küresel Demans Gözlemevi’nigeliştirdi. Her bireyin kendi beyin yaşlanma yörüngesi vardır, bu nedenle tedavi için arama nörodejeneratif hastalıkların patogenezkarmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. Belki de, her kişi onu ya da kendi patogenezi kişiselleştirilmiş bir yaklaşım gerektiren beyin dokusu nda yazılı sahip. Böylece, beyin dokusu nun çalışma nörodejenerasyon mekanizmaları anlamak için anahtar olacaktır.
Nörolojitarihine baktığımızda, en etkileyici ve çığır açan keşiflerin insan beyninin doğrudan incelenmesi olmadan asla gerçekleşemeyeceğini fark ettik. Zaman boyunca, çalışılacak beyin dokusunun kaynağı ham diseksiyonlar, rasgele ‘şans karşılaşmaları’ ve bazı durumlarda yasadışı ticaret, organize beyin koleksiyonları ve stratejik modern beyin bankaları değişti. Birçok etik yönleri göz önünde bulundurulması, modern beyin bankalarını geçmişin beyin koleksiyonlarından farklı etkileyen başlıca faktörlerden biridir. İlk gerçek modern Beyin Bankaları (BBs)20. Nicholas Corsellis ve Wallace Tourtelotte modern beyin bankacılığının öncüleri olarak kabul edilebilir. İngiltere’de, Corsellis çeşitli zihinsel ve nörolojikbozukluklar2 etkilenen 1000’den fazla iyi belgelenmiş beyinler üzerinde tutan bir koleksiyon monte . Ayrıca, Corsellis biyokimyasal testler uğruna buz taze beyin dokusu korumak için ihtiyaç ortaya yardımcı oldu3. Bu arada ABD’de, Wallace Tourtelotte potansiyel beyin donörlerin talep kolaylaştırmak ve toplanan beyinler tam bir tıbbi ve nörolojik geçmişi 4 eşlik etmesini sağlamak için antemortem beyin bağışı programları tanıttı4,5. Beyin koleksiyonları ve modern BB’ler hakkında tarihsel bir genel bakış için Carlos ve ark. 6 .
Peki neden hala insan beynine ihtiyacımız var? Beyin hastalıkları sadece nöropatolojik inceleme sonrasında kesin bir tanı verilebilir. Nöropatoloji klinik tanıyı zorlar ve klinik semptomların doğru yorumlanmasının ve yeni sindromik varyantların histolojik bazlarının keşfinin anahtarıdır. Gerçekten de tanı patolojik tabloya göre yeniden tanımlanabilir. Bununla birlikte, otopsi oranı yenilikçi nörogörüntüleme teknikleri nin son gelişimi nedeniyle son yıllarda azalmıştır. Beyin görüntüleme yoluyla, beyindeki morfolojik, fonksiyonel ve metabolik değişiklikler, hem de protein misfolding ölçüde, vivoolarak değerlendirilebilir . Ancak, in vivo nörogörüntüleme ve diğer biyomarker çalışmalar sadece ince hücresel ve moleküler değişiklikleri tespit edemiyoruz gibi patolojik resmin bir “tahmin” verebilir. Moleküler görüntülemedeki ilerlemeler ve yeni biyobelirteçlerin, hedef moleküllerin veizleyiciler7’nin (örneğin, amiloid, TAU, mikroglial izleyiciler) keşfi, insan beynini klinik değerlendirmeler ve biyomarker testlerinden elde edilen verilerin yorumlanması için daha da vazgeçilmez kılmaktadır. Ayrıca, omik teknolojileri (genomik, epigenomik, transkripsiyon, metabolomikler, proteomikler, lipidomikler, vb), taze ve dondurulmuş beyin dokusu üzerinde yapılan, hastalık mekanizmaları anlamak ve risk genleri keşfetmek için yeni olanaklar açtı, yeni tanı ve prognostik belirteçleri, ve potansiyel ilaç hedefleri8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Bu amaçlar için, modern BBs arşiv iyi karakterize, yüksek kaliteli beyin dokuları onları bilimsel topluluk için kullanılabilir hale3,24. BBs tarafından sağlanan beyinler tam bir klinik geçmişi eşlik etmelidir. BB’nin faaliyeti aşağıdakileri içerir: (1) Hastalıklı ve sağlıklı bireylerin beyin bağışı programlarına tanınması ve işe alınması; ideal koşul tam bir klinik, yaşam tarzı ve sosyal tarih elde etmek için yaşam boyunca donörlerin çok disiplinli bir takip elde etmek olacaktır, ve biyomarker profilleri; gerçekten de, bilişsel rezerv ve beyin yapısı yaşam tarzı ve sosyo-eğitim faktörleri bağlıdır25,26, bu yüzden bu bilgiler eldeki toplam veri zenginleştirir. (2) Beyin (beyin, beyincik ve beyin sapından oluşan) ve ilgili dokuların (örneğin, omurilik, kranial sinirler ve ganglia, vb.) donörün ölümünden sonra edinimi, tüm bunlar sırasında standart yasal ve etik düzenlemelere uyulması. (3) Uygun işleme (diseksiyon, fiksasyon, dondurma) beynin, standart bir operatif protokolde tanımlandığı gibi, yüksek kaliteli doku elde etmek ve multidisipliner araştırmalarda gelecekte kullanıma izin vermek. (4) Kesin tanıyı sağlayan ayrıntılı nöropatolojik karakterizasyon. (5) Depolama ve araştırma topluluğuna doku materyali dağıtımı27,28.
Tüm BB’ler hem dondurulmuş hem de formalin-sabit-parafin gömülü dokuları saklar. Her BB’nin kendi protokolü vardır. Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (New Jersey)29 ve serebrovasküler patoloji30Deramecourt çalışma bihemisferik kesme protokolü gibi özel çalışmalar dışında, dünyanın en büyük BBs sadece orta hat boyunca serebrum, beyincik ve beyin sapı kesti (sagittal düzlem). Bir yarısı taze incelenir ve daha sonra biyokimyasal çalışmalar için dondurulmuş, diğer histopatolojik değerlendirme için formalin sabitise. Biyokimyasal ve histopatolojik analizler her yarımkürede ayrı ayrı yapılır. Hangi tarafın sabit veya dondurulmuş (yanallık) olarak karar, tekil banka31,32,33,34,35bağlıdır. Birçok nörolojik hastalık asimetrik olduğu gibi, bizim BB taze beyin dilimleme için benzersiz bir protokol sunuyor: beyin sapı bitişik bölümleri ve her yarımküre dönüşümlü sabit ve dondurulmuş; bir yarımkürede sabit bir dilim diğer yarımkürede donmuş bir karşılık gelir. Bu yöntem le beyin dokusunun kullanımı optimize edilmiştir ve her iki yarımkürenin her iki alanından histolojik ve biyokimyasal bilgileri elde etme ve karşılaştırma olanağı ile tüm dondurulmuş maddelerin tam bir histolojik karakterizasyonu elde edilebilir.
Beyin bankası projemizin çerçevesi Abbiategrasso kasabasıdır. Abbiategrasso, Kuzey İtalya’da Milano şehrinin yaklaşık 22 km güneybatısında küçük bir kasabadır. Yaklaşık 32.600 kişilik bir nüfusa sahiptir. Golgi-Cenci (GC) Vakfı’naev sahipliği yapmaktadır. GC Vakfı büyük bir Rehabilitasyon Geriatrik Hastanesi (ASP Golgi-Redaelli) bir parçasıdır ve yaşlanma ve yaşlı bakımı hakkında araştırma odaklanan bir enstitüdür. Özellikle zihinsel yaşlanma, onu etkileyen sosyal ve davranışsal faktörler ve yaşa bağlı nörobilişsel bozuklukların (NPH) altında yatan biyoloji ve patolojiyi incelemeye odaklanır. 2009 yılında GC Vakfı 1321 katılımcıyla (1644 uygun deneden: ilk yanıt oranı %80,3) ile yeni bir uzunlamasına çalışma başlattı. 1935 ve 1939 yılları arasında (70-75 yaş ları arasında), Kafkas kökenli, aynı küçük coğrafi bölgede yaşayan doğdu. Çalışma InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; İngilizce: Beyin Yaşlanma Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) olarak adlandırıldı ve şu anda devam etmektedir. InveCe.Ab, demansın görülme sıklığını, prevalansını ve doğal tarihini değerlendirmek için maksimum homojenliğe ve en az değişkenliğe sahip bir kohort, davranışsal, psikososyal, klinik ve biyolojik değişkenler de dahil olmak üzere olası risk veya koruyucu faktörleri değerlendirmek için planlanmaktadır36. Kohortun özellikleri Şekil 1 ve Tablo 1’degösterilmiştir. Epidemiyolojik veriler Avrupa popülasyonundaki demans eğilimi ile tutarlıdır37,38 ve InveCe.Ab katılımcıları homojen genetik ve çevresel özelliklere sahiptir, normal yaşlanmadan nörobilişsel bozukluklara kadar olan yörüngeyi incelemek için iyi bir modeli temsil eder. Gerçekten de, homojen popülasyonlar yeterli istatistiksel güce ulaşmak için daha az deneklere ihtiyaç duyarlar. InveCe.Ab metodolojisi zaten başka bir yerdebildirilmiştir 36 ama periyodik kontroller yoluyla çok boyutlu yaklaşım altını çizmek için önemlidir (her 2-3 yılda) dahil değerlendirmeler aynı seti kullanarak: kan örnekleme (metabolik panel, homosistein ve vitaminler, profil Apolipoprotein E (APOE) ve biliş ve yaşlanma ile ilgili diğer genetik polimorfizmler için DNA ekstraksiyonu, antropometrik ölçümler (ağırlık, boy ve bel), Talking While Walking Test (çift görev testi), yaşam tarzı (Akdeniz diyet bağlılık, fiziksel aktivite ve bilişsel bağlılık düzeyleri) ve sosyal faktörler (sosyal tutulum, yalnızlık), bir nöropsikolojik değerlendirme ve klinik genel muayene değerlendirmek için bir röportaj. Bu kadar uzunlamasına verileri postmortem nöropatolojik verilerle karşılaştırmak araştırma için çok önemli olacaktır. Bu nedenle, ekibimiz ve özellikle Dr Michela Mangieri yukarıda belirtilen nöropatolojik yaklaşım gebe. 2014 yılından bu yana ve ikinci takip sırasında, InveCe.Ab katılımcıların beyinlerini bağışlamak istendi, ve böylece Abbiategrasso Beyin Bankası (ABB)doğum hakkında getirerek. ABB çekirdek bağış InveCe.Ab katılımcılar ama ABB şimdi diğer gönüllü bağış açıktır. Onlar ASP Golgi-Redaelli, farklı nörolojik hastalıklar veya ABB Projesi hakkında bilgi ve aynı coğrafi bölgeye ait yetişkin gönüllüler (Abbiategrasso ve çevresi) ile tutulmuş birkaç hasta ev hastalardır. Tüm bağışçılar aynı değerlendirme protokolünden geçer.
Yazarlar, normal yaşlanmanın bireysel yörüngelerini ve NCD’lere olası ilerlemeyi izlemek ve bu tür bağışçılardan elde edilen beyinleri doğru bir şekilde yönetmek, işlemek ve karakterize etmek için bir yöntem önermektedirler. Ayrıca amacımız, bireylerin beynin refahı ile ilgili periyodik nörolojik değerlendirmeler, seminerler ve eğitim faaliyetlerine katılmaları ve araştırma amacıyla beyin bağışı konusundaki farkındalıklarını artırmalarıdır.
Protokoldeki kritik adımlar
Amacımız, uzunlamasına gözlemden elde edilen detaylı geçmişe sahip konulardan gelen kaliteli dokuları elde etmek, karakterize etmek ve depolamaktır. Bu amaca ulaşmak için aşağıdaki temel hususlarla uğraşmak gerekmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, protokol ilk önemli adım olan bağışçıların işe alınması ile başlar. Daha sonra, bağışçıların takip programına devam etmesi ve beynin gerçek bağışına kadar zaman içinde projeye yapışmasını sürdürmeleri gerekmektedir. Ölüm anında, yeterli doku kalitesi için önemli olan otopsi ekibinin 24 saat içinde toplanması için ABB personelinin derhal bilgilendirilmeleri gerekmektedir. Serebral hemisferlerin taze kesimi sabit bir el ve belirli bir eğitim gerektirir. Yavaş donma nedeniyle hücresel hasar önlemek ve kriyostat ve Omics için kaliteli dilimler elde etmek için, hızlı bir şekilde dondurulmuş olması önemlidir. Formalin çözeltisinin (1 mm/saat) penetrasyon hızı göz önünde bulundurularak, doku antijenitesini korumak için tek dilimin ıslatma süresi minimumda tutulur.
Yöntemin sorun giderme
Yukarıda belirtilen kritik adımları ele almak için aşağıdaki yaklaşımı sunuyoruz. Donör alımı ve takiplere bağlılık: Vücudun figürü, saflık ve bütünlüğüne zarar verme korkuları veya ölümden sonra acı hissetme olasılığı da dahil olmak üzere beyin bağışını engelleyen çeşitli faktörler vardır. Hatta bazıları otopsinin hala hayattayken yapılabileceğinden endişe ediyor70,71. Cenaze düzenlemeleri ve mali yük bozulması ile ilgili endişeler de mevcuttur72. Ayrıca, bir sağlık personelinin ölüm sonrası prosedürler hakkında bilgi eksikliği ve potansiyel bağışçıların veya nok’larının endişelerini giderememeleri kayıt işlemlerini engelleyebilir. Tüm bu faktörler, kayıtlı katılımcı sayısının düşük olması ve zaman içinde donör kaybı olasılığının yüksek olması ile düşük bir farkındalık düzeyine neden olabilir. Gerçekten de, donör işe alma programı farkındalık yaymak, güven aşılamak ve kayıt ve takip katılım yüksek oranlarda korumak insanları ikna verimli olmalıdır. Deneyimlerimize göre, bu potansiyel bağışçıların dikkatli seçimi ve BB’nin amaçlarının ayrıntılı açıklaması yoluyla yapılır. Hem sağlıklı insanların hem de nörodejeneratif hastalıklardan ve ailelerinden etkilenenlerin korkularını ve ihtiyaçlarını karşılayan eğitim faaliyetleri ve empatik bir yaklaşım sunuyoruz. Potansiyel bağışçıların bizzat yaklaştıklarında rıza gösterme olasılıklarının daha yüksek olduğunu görüyoruz. Yüz yüze yaklaşım, beyin bağışı ve takip değerlendirmelerine yüksek bir kayıt yüzdesi elde etmek için temel olan karşılıklı güven ve saygıya dayalı bir ilişki yaratır. Güçlü bir etik anlayışına sahip yüksek eğitimli bir personel önce potansiyel bağışçıya yaklaşır, ölümden sonra beyni bağışlama olasılığını tartışır, insan beyin dokusunun nörobilimsel araştırmalara değerini açıklar ve ölüm sonrası prosedürlerle ilgili şüpheleri açıklar. Ağız olumlu kelime eşit derecede önemlidir. Beyin hasat sonra, uygun dikkat ve bakım kadavra yeniden oluşturmak için verilir. Kadavraya nazikçe davranarak merhuma saygı ve minnet göstermek önemlidir. Birkaç ay sonra, bir toplantı aile üyeleri tarafından istendiğinde nöropatolojik analiz sonuçlarını iletmek için planlanır.
Ölüm ve beyin hasadı zamanı: Kişi kabul ettiğinde donör olur ve 24 saat/gün, 7 gün/hafta (bize bağlı OLAN ASP Golgi-Redaelli Geriatri Hastanesi’nin resepsiyon numarası) iletişim kurmak için bir numara içeren bir kimlik kartı verilir. Ayrıca hastaneye yatış durumunda kullanılmak üzere yakınlarına yapıştırıcı etiketi verilir. Cenaze ekipleridaha önce cesedi otopsi ekibinin çağrıldığı ABB tesislerine getirmeleri için bilgilendirildi. Otopsi ekibi bir patolog, bir nörolog ve/ veya nörobiyolog ve bir anatomik oda teknisyeni, her gün 06:00-23:00 arasında nöbette olan oluşur; bazı stajyer öğrenciler de sık sık yardımcı olmak ve fotoğraf çekmek için mevcut.
Taze kesme prosedürlerinin hassasiyeti ve tutarlılığı, yöntemi geliştirmiş ve nöropatolojide birkaç yıllık deneyime sahip aynı iki operatörün (bir nörolog ve bir patolog) katılımı yla sağlanır. Dilimleri dondururken, önceden dondurulmuş alüminyum tepsiye konur ve onları iyi düz tutmak için birbirine bağlı bir alüminyum plaka ile kaplıdır. Hemen sonra, -80 °C’de depolamadan önce 3 dakika sıvı nitrojene konur. Sabitlenecek dilimler ayrı ayrı gazlı bez sarılır ve bir gün sonra yerine %10 fosfat tamponlu formalin çözeltisi içine batırılır. Daha sonra, en fazla 5 ek gün formalinda tutulur; ancak formalin çözeltisinin 1 mm/gün’e kadar nüfuz ettiğini göz önünde bulundurarak ıslatma süresini daha da kısaltmak istiyoruz.
Yöntemin sınırlamaları
Burada açıklanan araştırma yöntemi sadece sınırlı bir coğrafi alanı kapsamaktadır ve bağış programına katılan bireyler genel nüfusu tamamen temsil etmeyecek özelliklere sahiptir. Kabul edilebilirden daha fazla olmasına rağmen, 24 saate kadar bir postmortem aralığı bazı protein yapılarında değişiklikler üretebilir, enzimler ve beyin dokusunun RNA. AFS ve pH tayini doku kalitesini belirlemek için tamamen yeterli olmayabilir73 ve RNA bütünlüğüne dayalı doku kalitesini doğrulamak için başka yollar geliştiriyoruz.
Mikrotom kesme prosedürü ile ilgili olarak, anatomik ilişkilerin yeniden yapılanmasında çok yararlı olsa da, makrokesitlerin kullanımının basit olmadığı ve bazı teknik güçlükler sunduğu unutulmamalıdır. Yöntemimiz zorlu ve zaman alıcıdır. Maliyetleri oldukça yüksek ve finansman her zaman kolay değildir. Finansman öncelikle kamu (ASP Golgi-Redaelli Geriatri Hastanesi) ve özel kaynaklar (Golgi-Cenci Vakfı), özel bağışlar, kar amacı gütmeyen kuruluşlar (örneğin “Federazione Alzheimer Italia”) gelir ve katılım hibe.
ABB yönteminin mevcut/alternatif yöntemleraçısından önemi
Başlangıçta, beyin bağışı programımız InveCe.Ab uzunlamasına çalışmaya katılan bireyleri hedef aldı. Sonuç olarak, bağışlanan beyinler yıllar içinde toplanan ayrıntılı klinik, biyolojik ve sosyal bilgiler le birlikte verilir. ABB’nin gücü tam olarak bu ayırt edici kökenden kaynakla türetilmiştir. Gerçekten de, biyolojik özellikleri ve çevresel maruziyetleri paylaşan sosyal ve genetik olarak ilişkili bir grup insanı incelemek istatistiksel analizi geliştirir. Ayrıca, çalışma aşağıdaki yararları içerir: 1) Toplumun ihtiyaçlarını göz etmek ve sağlamak (“sormadan önce verme” eylemi): insanlar pratisyen hekime bilgi verilen ücretsiz bir periyodik kontrol alırlar, sekreterimizin bir telefon numarası istişareler için sağlanır ve ağır özürlüler evlerinde ziyaret edilir; 2) Periyodik seminerler (beyin sağlığı, beyin bağışı ve genel sağlık ile ilgili) ve tematik derslerin planlanması (örn. yaşlılar için bilgi teknolojisi cihazlarının kullanımı) aracılığıyla, katılımcılara, kamu salonlarıve pratisyen hekimlerin eğitim faaliyetlerine katılmaları; 3) İnsanlarla tanışmak ve yüz yüze bir yaklaşım benimsemek. Tüm bu unsurlar ABB projesinin gücünü oluşturmaktadır. Ayrıca, proje ilgili tıbbi personelin klinik yeteneklerini geliştirir, onlar antemortem değerlendirmeler ve postmortem nöropatolojik değerlendirmeler hem de deneyim kazanmak gibi. Bu bağlamda, “Azınlık yaşlanma araştırma çalışması” çok tuhaf bir deneyim söz etmek istiyorum. Bu çalışma, Chicago bölgesinde yaşayan sınırlı ve seçilmiş sayıda Afrikalı Amerikalıyı kapsıyor (1.357 uygun deneğin 784’ü: yanıt oranı %57). Katılımcılar her yıl evlerinde ziyaret edildi ve beyin bağışı programına katılmaları istendi. Bu çalışma, beyin bağışı programına yüksek oranda olumlu yanıt almak bizimkine benzerliği olan alışılmadık bir yaklaşıma dayanmaktadır (784 katılımcıdan 352’si kayıtlıydı: %44, otopsi oranı oldukça tatmin edici olmasa da (%53)74. Tıpkı “Azınlık yaşlandırma araştırması” çalışmasında olduğu gibi, eğitim faaliyetleri ve empatik bir yaklaşım sunarak mükemmel sonuçlar elde ediyoruz. Özellikle yanıt oranımız %93, kayıt oranımız %28.7 ve şu anda otopsi oranı %67. Bu oranlar, insanları doğrudan ilgilendiren projelerin bağışların daha önemli bir yüzdeye sahip olduğunu göstermektedir. Diğer beyin bağışı programları, potansiyel bağışçılar ile bir ilişki bina içine daha az dikkat ile, genellikle düşük bir kayıt yüzdesi var, etrafında olmak 10-15% veya daha az73,75.
Nöropatolojik analizle biten daha önceki birkaç kohort çalışması vardır. Ayrıca, beyin bankaları ve depoların çoğunluğu hastalık merkezli ve sağlıklı donörler “hastalıklı” beyin sayısına göre “kontrol” beyin bir kıtlığı vardır. Sadece sınırlı,sayıda BBs73,74, 76,,7777,78,79,80yaşlanma yörüngeleri çalışma için hem hastalıklı hem de normal konuları içeren nüfus çalışmaları dayanmaktadır. ABD74’teki “Azınlık yaşlandırma araştırması” ve Finlandiya76’daki “Vantaa 85+ çalışması” gibi bazı çalışmalar bizimkine benzer olmakla birlikte kohortun sona ermesiyle sonuçlanması eğilimindedir. Bunun yerine, ABB’nin bağış programının gelecekte de uzun bir süre devam etmesi, potansiyel bağışçıların yer aldığı ve InveCe.Ab uzunlamasına çalışmanın bitiminden sonra bile takipleri planlaması öngörülüyor. Bu yaklaşım, işe alım yöntemimizi emeklilik topluluğunu hedefleyen “Güneş Sağlığı Araştırma Enstitüsü (SHRI) beyin bağışı programına” benzer hale getirir73. Beyin bağışı için SHRI protokolü dünyanın en kısa ortalama ölüm sonrası aralığı (3.92 saat) ile çok etkilidir. Dünyanın en büyük BBs benzer, SHRI protokolü sadece orta hat (sagittal düzlemde) içinde serebrum, beyincik ve beyin sapı kesti, sonra bir yarısı taze ve biyokimyasal çalışmalar için dondurulmuş kesilir, diğer histopatolojik değerlendirme için formalin sabittir. Ancak, SHRI diseksiyon protokolünün güçlü yanlarından biri, tüm yarımküre yerine tek tek dilimlerin fiksasyonudur. Gerçekten de, bir yarımküreyi bir bütün olarak sabitlemek, yüzey ve çekirdek arasındaki farklı fiksasyon degradeleri nedeniyle en uygun olmaz. Ayrıca, kortikal proteinler formalin çözeltisine uzun süreli maruz kalma dan etkilenebilir. Böylece, neden tek tek dilimleri düzeltmek için karar nedeni.
Hangi tarafın sabit veya dondurulmuş olarak karar, tekil banka bağlıdır (her zaman aynı, rasgele atanan veya diseksiyon günü tek ya da çift olup olmadığına bağlı olarak atanmış)31,32,33,34,35. Biyokimyasal ve histopatolojik analizler her yarımkürede ayrı ayrı yapılır. Birçok nörolojik hastalık asimetrik olduğundan, BB’miz taze numuneleri dilimlemek için benzersiz bir protokol sunar: beyin sapından ve beyincik ve serebrumun her yarımküresinden alternatif kesitler sabit veya dondurulmuş malzeme olarak korunur; bir yarımkürede sabit bir dilim diğer yarımkürede donmuş bir karşılık gelir. Yöntemimiz, tüm dondurulmuş maddelerin tam bir histolojik karakterizasyonu elde etmek ve her iki tarafın her alanında nsonuçlarını karşılaştırma fırsatı verir. Girişte de belirtildiği gibi, açıklanan yöntem bize beyin dokusundan mümkün olduğunca çok bilgi elde etmek için izin verir. Ayrıca, ABB yöntemi hemen hemen tüm bilinen beyin proteinopatileri ve vasküler patoloji de dahil olmak üzere temel ama tam bir nöropatolojik karakterizasyon, verir. Bilişsel bozukluğun belirlenmesinde vasküler yaralanmaların tartışmalı rolü nedeniyle, vasküler yük30,53için bir çift puanlama kullanmaya karar verdi.
Protokolde açıklandığı gibi, çok disiplinli bir yaklaşım kullanıyoruz. Bu zaman alıcı ve emek li bir yöntem olmasına rağmen, araştırma için çeşitli avantajlar sağladığına inanıyoruz. Örneğin, bir önceki çalışmada, biz kendi başına yüksek tHcy veya APOE-ε4 alel ile ilişkili MTHFR C677T TT, bellek kaybı yerine yönetici işlev bozuklukları ile ilgili olabileceğini gösterdi81. Bu nedenle, nöropatolojik düzeyde bu özel genetik profili olan konuları değerlendirmek ilginç olabilir. Bu, bankamızda toplanan biyolojik materyallerin araştırılması yoluyla doğrulanabilir yeni araştırma hipotezleri oluşturmada bu tür derinlemesine takibin nasıl yararlı olduğuna bir örnektir. Yaklaşımımızın avantajının bir diğer göstergesi de QEEG’nin, orijinalliği ve göreceli kullanım kolaylığı açısından rutin olarak gerçekleştirdiğimiz değerlendirmeler arasında yer alan bir diğer gösteridir. Nitekim, EEG kortikal piramidal nöronlar82ait dendritlerin elektriksel potansiyelleri kaydederek serebral korteksin sinaptik aktivitesini algılar . QEEG biliş83ile ilgili kortikal sinaptik aktivite nin tahmini için bir biyomarker olarak kabul edilebilir. Özellikle, düşük frekanslarda genel bir artış ile beynin arka kısmında alfa ritimlerinde bir azalma (teta ve delta ritimleri) kortikal bağlantı arıza ile ilgili olmuştur. Bu tanı korelasyon çalışmalarının çoğu sadece olası ve kesin bir tanı84,85,86,87bir klinik tanı dayalı olduğu düşünülmelidir. Sadece çok az hedeflenen çalışmalar QEEG ve LTS varyantları arasındaki korelasyon araştırmak için nöropatolojik resim ile QEEG verileri karşılaştırdık88,89, ftld ve AD83arasındaki ayrım . Çalışmamızı nöropatolojik tanı tanımı ile bitirerek, serebral elektriksel aktivite üzerine yapılan gözlemleri doğru bir şekilde yorumlamak mümkündür. Ayrıca her konuda seri QEEG’yi gerçekleştirerek, intra-bireysel EEG dalgalarının yörüngesini ve nöropatolojik resimle olan bağıntılarını takip edebiliriz. Zaman içinde kortikal elektriksel aktivitebireysel değişiklikler aşağıdaki incipient demans için bir biyomarker olarak anlamını daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
Gelecekteki uygulamalar ve yöntemin yönü
Doku dağılımının uygulanması ana hedeflerimizden biridir. Bunu yapmak için, biz sadece GC Vakfı (geriatri), Pavia Üniversitesi Nöroloji bir akademisyen, gc Vakfı ve Geriatri Hastanesi ASP Golgi-Redaelli hem de bir nörolog ve bir patolog direktörü de dahil olmak üzere bilimsel bir komisyon kurdu. Beyin dokusu, histolojik slaytlar ve diğer biyolojik örnekleri dağıtırken, bağışçıların araştırma amacıyla bağışı kabul ettiğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle malzeme nin dağıtımı, BNE Davranış Kuralları40’taaçıklandığı gibi ihtiyatlı bir şekilde gerçekleşmelidir. Malzeme için bir istek tespül eden taraflar, gerekli numunenin türünü ve miktarını belirtmeli, araştırma projesinin açıklamasını ve numunelerin nasıl kullanılacağını ve mümkün olduğunda önceki yayınların kanıtlarını sağlamalı (transfer anlaşması için Şekil 9’abakınız). Beyin bankası finansal kazanç için çalışmıyor. Yani, araştırmacılar tarafından ödenen ücretler sadece doku temini, işleme, depolama ve dağıtım giderlerini kapsamalıdır.
Proteomik ve transkripsiyon gibi ekzom dizilimi ve Omics teknikleri ile vakaları analiz etmeye başlama planları harekete geçti. Alternatif örnekleme metodolojimiz, her iki yarımküreden histolojik olarak iyi tanımlanmış dokular üzerinde omik çalışmalarının yapılmasına olanak sağlayacaktır. Bu yaklaşım la aynı yarımkürenin farklı beyin bölgelerinde ve diğer yarımkürenin ilgili bölgelerinde gen aktivasyon paterni karşılaştırmak mümkün olacak ve histopatoloji ile gen aktivasyonu ilişkilendirmek mümkün olacaktır. Bu alanda, histolojik slaytların bilgisayarlı analizi ve klinik, histolojik ve omik verilerin en son korelasyonunu içeren derin öğrenme uygulamaları büyük ilgi göstereceği dir. Birçok farklı değişken arasındaki diğer korelasyonlar ve diğer olası teknolojik uygulamalar tanımlanabilir. Her iki yarımküreden gelen dondurulmuş maddelerin kullanılabilirliği gen aktivasyonu ve protein dağılımının doğru bir topografyasını sağlayacaktır. Bu sağlıklı konularda bile özellikle ilgi olacaktır, hem beyin fonksiyonları ve bazı hastalıklar asimetrik olduğu göz önüne alındığında.
Ayrıca, iyi karakterize beyin donörlerinden hücre kültürleri elde edebilirsiniz. Gerçekten de, hasat beyinleptomeninges gelen hücre kültürleri hastalık veya yaşlanma mekanizmaları daha fazla araştırma için kullanılabilir canlı hücreleri kaynağı, indüklenen pluripotent kök hücreleri sayesinde (iPSCs) leptomeningeal fibroblastlar yeniden programlama ve ileri modellerde nöral hücrelere ayırarak içerir90.
Beyin yaşlandıkça, farklı değişim profilleri moleküler, hücresel ve doku düzeyinde oluşabilir. Her beyin eşsizdir. Her iç ve dış stres yanıt kendi yolu vardır; bazıları direnirken, diğerleri farklı patolojiler gösterir. Klinik tablo ile nöropatolojik tablo arasındaki tutarsızlıklar genellikle vardır, çünkü lezyonların topografyası moleküler doğalarından çok klinik sunumu belirler. Doğru ve kesin tanı ancak klinik sendrom ile nörolojik bulgularla birleştirilerek elde edilebilir ve bu bulgular hastalıkların patogenezini çözmek için gerekli önemli etiyolojik ipuçlarını eklemektedir. Avrupa’da nöropatolojik tanıya standart bir yaklaşım oluşturma çabası vardır. Tanı protokolümüz neredeyse tamamen beyin bankacılığı için nöropatolojik tanı ile ilgili son yayınlanan yönergeleri izler91. Bu bize toplamak ve iyi belgelenmiş beyin dokusu paylaşmak için izin verecektir, ilk İtalyan Beyin Bankası kurma potansiyel amacı ile. Nitekim, İtalya’da beyin depoları ama kohort çalışmalara dayalı beyin bankaları vardır. Amacımız, İtalya genelinde yaygın olarak uygulanabilecek beyin dokusu hasat için ortak bir protokol kullanan ve benzer materyalleri paylaşan bir ağ kurmak için bir yöntem geliştirmektir. Bunu yapmak için, diğer araştırma merkezlerinin katılımı ve belirli bir web sitesinin oluşturulması gelecek için ana hedefler arasında yer almaktadır.
Yenilikçi teknolojiler sürekli nörodejeneratif hastalıkların moleküler doğasının analizi ve biyomarker tanımlama için kullanılmaktadır. Bu bağlamda, nöropatolojik olarak doğrulanmış epidemiyolojik yaklaşımın önemini vurgulayan, uzunlamasına çalışmalarla elde edilen bilişsel ve yaşlanma yörüngeleri hakkında bilgiler eşliğinde beyinlere giderek artan bir ihtiyaç olacaktır92.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmayı Dr.ssa Michela Mangieri’ye ithaf etmek istiyoruz. O erken ölmeden önce, o gebe ve Abbiategrasso Beyin Bankası Projesi başladı.
Biz cömertçe kendi vücudunun en asil organ bağış araştırma katkıda bulunan beyin bağışçıları için müteşekkiriz; onlar olmadan bu araştırma mümkün olmazdı.
Valeria Marzagalli’ye ABB projesindeki değerli çalışmaları için minnettarız.
Yazarlar, değerli rehberlik ve bilge danışman için Prof Johannes Attems, Dr Paolo Fociani ve Dr Giorgio Giaccone teşekkür ederiz.
Dr.sa Alice Cirrincione ve Bayan Giulia Bortone’a proje boyunca yaptıkları değerli yardımlar için teşekkür ederiz.
Bayan Tere Cassani’ye desteği ve işbirliği için “Federazione Alzheimer Italia” için çok teşekkür ederiz.
Yazarlar Dr Matteo Moretti ve Prof Antonio Marco Maria Osculati, Halk Sağlığı, Deneysel ve Adli Tıp, Pavia Üniversitesi Bölümü müteşekkir.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |