पैराइटल एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन में शामिल रास्तों का विश्लेषण करने के लिए एक पूर्व वीवो परख के रूप में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ
Summary
यह लेख माउस गुर्दे से अलग किए गए एनकैप्सुली ग्लोमेरुली के ग्लोमेरुलर पैराइटल एपिथेलियल सेल आउटग्रोथ का विश्लेषण करने और विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार और माइग्रेशन में शामिल रास्तों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
पैराइटल एपिथेलियल सेल (पीईसी) सक्रियण ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस के विकास और प्रगति में शामिल प्रमुख कारकों में से एक है। इसलिए पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में शामिल रास्तों का अवरोध ग्लोमेरुलर रोगों की प्रगति को कम करने के लिए एक उपकरण हो सकता है। यह लेख संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है और माउस गुर्दे से अलग किए गए एनकैप्सुली ग्लोमेरुली के पार्श्व एपिथेलियल सेल वृद्धि का विश्लेषण करता है। अलग माउस गुर्दे विच्छेदन के बाद, ऊतक कीमा बनाया हुआ है, और ग्लोमेरुली को सिविंग द्वारा अलग किया जाता है। एनकैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली एकत्र किए जाते हैं, और एकल ग्लोमेरुली को पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं की ग्लोमेरुलर वृद्धि प्राप्त करने के लिए 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। इस अवधि के दौरान, पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार और माइग्रेशन का विश्लेषण सेल संख्या या आउटग्रोइंग कोशिकाओं के सतह क्षेत्र का निर्धारण करके किया जा सकता है। इसलिए इस परख का उपयोग ट्रांसजेनिक-या नॉकआउट-चूहों में एक परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति के प्रभावों या पार्श्व एपिथेलियल सेल विकास विशेषताओं और सिग्नलिंग पर संस्कृति की स्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण की प्रक्रिया में शामिल महत्वपूर्ण रास्तों और इसके परिणामस्वरूप ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस का अध्ययन किया जा सकता है।
Introduction
ग्लोमेरुलर रोग गुर्दे के विकारों का एक महत्वपूर्ण समूह हैं और अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ईएसआरडी) का एक प्रमुख कारण प्रतिनिधित्व करते हैं। दुर्भाग्य से, विशिष्ट उपचार विकल्प सीमित हैं और ईएसआरडी के लिए प्रगति अपरिहार्य है। ग्लोमेरुलर रोगों को ग्लोमेरुलर चोट की उपस्थिति से परिभाषित किया जाता है और भड़काऊ और गैर-भड़काऊ बीमारियों में समूहित किया जा सकता है। यद्यपि प्रारंभिक अपमान अलग है, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक सामान्य सेलुलर तंत्र ग्लोमेरुलर एपिथेलियल सेल हाइपरप्लासिया की ओर जाता है और अंततः सभी ग्लोमेरुलरस्लोरोसिस में ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस की ओर जाता है, चाहे अंतर्निहित कारण1,,2,,3,,4हो।
विशेष रूप से, यह दिखाया गया था कि ग्लोमेरुलोस्क्लेरोटिक घाव मुख्य रूप से सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं5,,6से बने होते हैं। शारीरिक परिस्थितियों में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं सपाट शांत एपिथेलियल कोशिकाएं होती हैं जो ग्लोमेरुलस के बोमन कैप्सूल को लाइन करती हैं। हालांकि, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों (जैसे, पोडोकोन्ड्रियल साइटोपैथी), सूजन या हाइपरफिल्ट्रेशन (उदाहरण के लिए, कम गुर्दे के द्रव्यमान, उच्च रक्तचाप, मोटापा या मधुमेह मेलिटस के कारण) के कारण किसी भी ग्लोमेरुलर चोट पैरिटल एपिथेलियल कोशिकाओं की सक्रियता को ट्रिगर कर सकती है। सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं जन्म देती हैं और बाह्य कोशिकाओं को जमा करती हैं जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर वर्धमान या स्क्लेरोटिक घाव5,7,8होते हैं ।8 इन प्रक्रियाओं की प्रगति के परिणामस्वरूप गुर्दे के कार्य9की हानि होती है । इसलिए, पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन भड़काऊ और गैर-भड़काऊ ग्लोमेरुलरस्लोरुलरसिवसैस दोनों में ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस के विकास और प्रगति में एक महत्वपूर्ण कारक है1,2,,3,,4,,10.
आणविक प्रक्रियाएं मध्यस्थता पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं de novo एक्सप्रेस CD44, एक रिसेप्टर है कि सेलुलर प्रसार और प्रवास में शामिल विभिन्न रास्तों की सक्रियता के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सीडी 44 के अवरोध को पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण को बाधित करने और भड़काऊ के साथ-साथ गैर-भड़काऊ ग्लोमेरुलर रोगों के पशु मॉडलों में वर्धमानगठन,और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस की प्रगति को कम करने के लिए दिखाया गयाथा।
चूंकि पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस और वर्धमान गठन के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है, इन कोशिकाओं का अवरोध ग्लोमेरुलर रोगों की प्रगति को धीमा कर सकता है। पैराइटल एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन को चलाने वाले आणविक रास्तों की स्पष्टता से विशिष्ट चिकित्सीय हस्तक्षेपों का विकास हो सकता है जो ग्लोमरुलर रोग में हाइपरप्लास्टिक और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोटिक घावों के गठन को कम करते हैं।
प्रायोगिक पशु मॉडलों में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर एक परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति (नॉक-आउट मॉडल या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल) या दवा उपचार के प्रत्यक्ष प्रभाव के लिए सबूत प्रदान करना अक्सर मुश्किल होता है। एक पारंपरिक नॉक आउट माउस में वीवो परिवर्तनों में मनाया गया पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में सीधे परिवर्तन ों द्वारा समझाया जा सकता है। हालांकि, चूंकि जीन अभिव्यक्ति को माउस के भीतर अन्य सेल प्रकारों में भी बदल दिया जाता है, इसलिए कोई अन्य कोशिका प्रकारों द्वारा मध्यस्थता किए गए अप्रत्यक्ष प्रभावों को बाहर नहीं कर सकता है। मुख्य रूप से पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में सक्रिय प्रमोटरों द्वारा संचालित सशर्त क्रे-लोक्स चूहों के विकास ने कुछ मामलों में एक समाधान प्रदान किया है13। फिर भी, सशर्त ट्रांसजेनिक मॉडल जटिल हैं और हालांकि अधिक सशर्त लाइनें उपलब्ध हो जाती हैं, पारंपरिक नॉक आउट या ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में से कई के लिए अभी तक सशर्त विकल्प नहीं है।
पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमारे समूह ने पैराशियल एपिथेलियल सेल प्रसार और प्रवासन को मापने और विश्लेषण करने के लिए माउस गुर्दे से अलग एकल समझाया ग्लोमेरुली का उपयोग करके एक पूर्व वीवो परख विकसित की है। यह विधि हमें पार्श्व एपिथेलियल सेल विशिष्ट प्रभावों को निर्धारित करने और इस सक्रियण को बाधित करने के लिए पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण और परीक्षण उपचार विकल्पों के लिए जिम्मेदार रास्ते खोजने में सक्षम करेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोई भी पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए एकल एनक्सुलेटेड ग्लोमेरुली का उपयोग कर सकता है जो पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण का परिणाम है। य?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को डच किडनी फाउंडेशन (ग्रांट 14A3D104) और नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ विडी ग्रांट: 016.156.363) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Riferimenti
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