Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal
Summary
Este artigo descreve um método para culminar e analisar os crescimentos de células epiteliais parieais glomerulares de glomeruli encapsulado isolados do rim do rato. Este método pode ser usado para estudar caminhos envolvidos na proliferação e migração de células epiteliais parietal.
Abstract
A ativação da célula epitelial parietal (PEC) é um dos fatores-chave envolvidos no desenvolvimento e progressão da glomerulosclerose. A inibição de vias envolvidas na ativação de células epiteliais parietal pode, portanto, ser uma ferramenta para atenuar a progressão de doenças glomerulares. Este artigo descreve um método para cultivar e analisar o crescimento das células epiteliais parietal do glomeruli encapsulado isolado do rim do rato. Após dissecar rins isolados de camundongos, o tecido é picado, e glomeruli são isolados por peneira. Glomeruli encapsulado são coletados, e glomeruli único são cultivados por 6 dias para obter crescimento glomerular de células epiteliais parietal. Durante esse período, a proliferação e migração de células epiteliais parietal pode ser analisada determinando o número celular ou a área superficial das células em crescimento. Este ensaio pode, portanto, ser usado como uma ferramenta para estudar os efeitos de uma expressão genética alterada em camundongos transgênicos ou nocautes ou os efeitos das condições culturais nas características e sinalização das células epiteliais parietal. Utilizando este método, podem ser estudadas caminhos importantes envolvidos no processo de ativação de células epiteliais parietal e, consequentemente, na glomerulosclerose.
Introduction
As doenças glomerulares são um importante grupo de distúrbios renais e representam uma das principais causas da doença renal em estágio terminal (ESRD). Infelizmente, as opções específicas de tratamento são limitadas e a progressão para a ESRD é inevitável. As doenças glomerulares são definidas pela presença de lesões glomerulares e podem ser agrupadas em doenças inflamatórias e não inflamatórias. Embora o insulto inicial seja diferente, estudos recentes têm demonstrado que um mecanismo celular comum leva à hiperplasia epitelial glomerular e, em últimainstância,à glomerulosclerose em todas as doenças glomerulares, independentemente da causa básica1,,2,,3,4.
Especificamente, foi demonstrado que as lesões glomeruloscleróticas são compostas principalmente de células epiteliais parietal ativadas5,6. Sob condições fisiológicas, as células epiteliais parietal são células epiteliais quiescentes planas que revestem a cápsula do Bowman do glomerulus. No entanto, qualquer lesão glomerular devido a mutações genéticas (por exemplo, citopatias específicas podocyte ou mitocondrial), inflamação ou hiperfiltração (por exemplo, causada pela redução da massa renal, hipertensão, obesidade ou mellitus diabético) pode desencadear a ativação de células epiteliais parietal. Células epiteliais parietal ativadas proliferam e depositam matriz extracelular que resulta na formação de crescentes celulares ou lesões escleróticas5,,7,,8. A progressão desses processos resulta na perda da função renal9. Portanto, a ativação de células epiteliais parietal é um fator-chave no desenvolvimento e progressão da glomerulosclerose tanto inflamatória quanto não inflamatóriaglomerular 1,,2,,3,,4,,10.
Os processos moleculares que mediam a ativação de células epiteliais parietal ainda são amplamente desconhecidos. Estudos recentes mostram que as células epiteliais parietal ativadas de novo expressAM CD44, um receptor que é importante para a ativação de diferentes caminhos envolvidos na proliferação e migração celular. Além disso, a inibição do CD44 mostrou-se inibir a ativação de células epiteliais parietal e atenuar a progressão da formação crescente e glomerulosclerose em modelos animais de doenças inflamatórias e glomerulares não inflamatórias11,,12.
Como a ativação de células epiteliais parietal é um ator-chave para o desenvolvimento da glomerulosclerose e formação crescente, a inibição dessas células poderia retardar a progressão de doenças glomerulares. A elucidação das vias moleculares que conduzem a ativação epitelial parietal pode levar ao desenvolvimento de intervenções terapêuticas específicas que atenuam a formação das lesões hiperplásticas e glomeruloscleróticas na doença glomerular.
Em modelos animais experimentais, é frequentemente difícil fornecer evidências para um efeito direto de uma expressão genética alterada (modelos de knock-out ou modelos de camundongos transgênicos) ou tratamento medicamentoso nas células epiteliais parietal. Em um camundongo knock-out convencional, as alterações in vivo observadas podem ser explicadas por mudanças diretas nas células epiteliais parietal. No entanto, uma vez que a expressão genética também é alterada em outros tipos de células dentro do mouse, não se pode excluir efeitos indiretos mediados por outros tipos de células. O desenvolvimento de camundongos cre-lox condicional impulsionados por promotores principalmente ativos em células epiteliais parietal forneceu uma solução em alguns casos13. No entanto, modelos transgênicos condicionais são complexos e, embora linhas mais condicionais se tornem disponíveis, para muitas das linhas convencionais de camundongos ou transgênicos ainda não há um substituto condicional.
Para estudar os efeitos diretos nas células epiteliais parietal, nosso grupo desenvolveu um ensaio ex vivo usando glomeruli encapsulado único isolado dos rins do rato para medir e analisar a proliferação e migração de células epiteliais parietal. Este método nos permitirá determinar efeitos específicos de células epiteliais parietal e encontrar caminhos responsáveis para a ativação de células epiteliais parietal e testar opções de tratamento para inibir essa ativação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando o protocolo descrito neste artigo, pode-se usar glomeruli encapsulado único para avaliar a proliferação de células epiteliais parietal, que é uma consequência da ativação de células epiteliais parietal. Este modelo ex vivo nos permitirá estudar detalhadamente as vias moleculares, que estão envolvidas na ativação de células epiteliais parietal. O método descrito baseia-se no simples conceito de dissecção renal e peneira para isolar e cultura encapsulada glomeruli e comparar a proliferação e/ou mi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Dutch Kidney Foundation (grant 14A3D104) e pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (bolsa NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Riferimenti
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