Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans
Summary
Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.
Abstract
Em organismos vivos, a hiperpermebilidade intestinal é um sintoma grave que leva a muitas doenças inflamatórias intestinais (DII). Caenorhabditis elegans é um modelo animal não mamífero que é amplamente utilizado como um sistema de ensaio devido à sua curta vida útil, transparência, custo-eficácia e falta de questões éticas animais. Neste estudo, um método foi desenvolvido para investigar os efeitos de diferentes bactérias e 3,3′-diindolylmethane (DIM) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans com um sistema de análise de imagem de alta produção. Os vermes foram infectados com diferentes bactérias do intestino ou cotratados com DIM por 48 h e alimentados com isotiocianato de fluorescena (FITC)-dextran durante a noite. Em seguida, a permeabilidade intestinal foi examinada comparando as imagens de fluorescência e a intensidade da fluorescência dentro dos corpos do verme. Este método também pode ter o potencial de identificar bactérias intestinais probióticas e patogênicas que afetam a permeabilidade intestinal no modelo animal e é eficaz para examinar os efeitos de produtos químicos nocivos ou promotores da saúde sobre permeabilidade intestinal e saúde intestinal. No entanto, este protocolo também tem algumas limitações consideráveis a nível genético, especialmente para determinar quais genes são alterados para controlar a doença, porque este método é usado principalmente para determinação phenotípica. Além disso, este método é limitado a determinar exatamente quais substratos patogênicos causam inflamação ou aumentam a permeabilidade dos intestinos dos vermes durante a infecção. Portanto, são necessários mais estudos aprofundados, incluindo a investigação do mecanismo genético molecular usando bactérias mutantes e nematóides, bem como a análise de componentes químicos de bactérias, são necessários para avaliar plenamente a função de bactérias e produtos químicos na determinação da permeabilidade intestinal.
Introduction
A permeabilidade intestinal é considerada como uma das principais barreiras relacionadas à microbiota intestinal e à imunidade mucosa e é provável que seja afetada por vários fatores, como modificações de microbiota intestinal, comprometimento epitelial ou alterações de camada de muco1. Trabalhos recentes relataram protocolos eficazes para medir a permeabilidade intestinal das células intestinais humanas cultivadas, analisando as taxas de fluxo de fluorescência em toda a camada de células intestinais2,mas menos trabalhos de pesquisa apresentam um procedimento adequado para medir a permeabilidade intestinal em nematóides, particularmente em C. elegans, usando manchas fitc-dextran.
Existem dois protocolos representativos para medir a permeabilidade intestinal em C. elegans usando vermelho Nilo3 e dissodium erioglaucine (ou o ensaio Smurf)4,5. Neste protocolo, usamos FITC-dextran (peso molecular médio 10.000), que tem um peso molecular muito maior do que o vermelho do Nilo (MW = 318,37) e dissodium erioglaucine (MW = 792,85). FITC-dextran é mais semelhante ao vermelho do Nilo ou corantes dissimeses erioglaucinos aos nutrientes macromoleculares reais, como carboidratos, que são absorvidos através da camada intestinal. A permeabilidade intestinal de C. elegans alimentada com disódio erioglaucine (corcel azul Smurf) pode ser facilmente avaliada sem microscopia de fluorescência. No entanto, no ensaio do Smurf, a análise quantitativa da permeabilidade intestinal é difícil devido à falta de padronização e deve ser avaliada manualmente4,5. No caso do ensaio vermelho do Nilo, o vermelho do Nilo também mancha sídropis lipídicos nas células, o que pode interferir com a determinação exata da permeabilidade intestinal em C. elegans6. Os protocolos atuais permitem a análise quantitativa rápida e precisa da permeabilidade intestinal em C. elegans tratados com várias bactérias e produtos químicos intestinais ao evitar a coloração lipid inespecífica.
C. elegans é um modelo típico em campos biológicos devido ao seu preço acessível, manipulação fácil, questões limitadas de ética animal, e vida útil curta, que é benéfico para a experimentação rápida7. Em particular, depois que todo o genoma de C. elegans foi publicado, quase 40% dos genes no genoma de C. elegans foram encontrados para ser ortologous aos genes que causam doenças humanas8. Além disso, o corpo transparente permite a observação dentro do organismo, que é vantajoso para pesquisar eventos celulares e para aplicações de fluorescência na biologia celular, por exemplo, manchas de células-tronco com DAPI ou imunohistoquímica9. C. elegans é frequentemente usado como um animal experimental para estudar a interação entre a microbiota intestinal e o hospedeiro; além disso, C. elegans é usado para rastrear bactérias probióticas promotoras de saúde10,11,12, bem como produtos químicos dietéticos que promovem a saúde intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis são bactérias intestinais bem conhecidas que afetam negativamente o sistema gastrointestinal, especialmente as células epiteliais colônicas do trato intestinal15,16. Portanto, medir a permeabilidade intestinal desencadeada por essas bactérias é necessário para o rastreamento e desenvolvimento de novos medicamentos que podem recuperar e reduzir os danos causados pela inflamação bacteriana e infecção. Neste protocolo, testamos os efeitos dessas bactérias intestinais sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans.
Também relatamos um protocolo otimizado para testar produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans. Para este fim, usamos 3,3′-diindolylmethane (DIM) como um modelo químico porque DIM é um composto de metabólito bioativo derivado do indole-3-carbinol, que está presente em plantas alimentares Brassica, e tem sido relatado para ter efeitos terapêuticos sobre ibd em camundongos17,18. Além disso, descobrimos recentemente que dim melhora a disfunção de permeabilidade intestinal em ambas as células intestinais humanas cultivadas, bem como o modelo nematódeo C. elegans19.
Neste estudo, utilizámos três condições experimentais diferentes. Primeiro, medimos os efeitos das diferentes bactérias, P. aeruginosa e E. faecalis, sobre permeabilidade intestinal(Figura 1). Em segundo lugar, medimos os efeitos do P. aeruginosa inativo ao vivo e inativado pelo calor sobre a permeabilidade intestinal(Figura 2). Em terceiro lugar, medimos os efeitos do DIM (um modelo químico) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans alimentados com P. aeruginosa (Figura 3).
O objetivo deste estudo foi desenvolver protocolos otimizados que medem a permeabilidade intestinal de C. elegans,que é alterado pelo tratamento com várias bactérias intestinais, bem como com produtos químicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando este novo método para determinar a permeabilidade intestinal em C. elegans, que combina microscopia fluorescência automatizada e análise quantitativa de imagem, as diferenças causadas por microorganismos intestinais ou produtos químicos podem ser determinadas in vivo, especificamente no intestino C. elegans. Este protocolo é útil para investigações de permeabilidade intestinal e aplicável a muitas tarefas, como determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) condições de e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa intramural do Instituto de Ciência e Tecnologia da Coreia (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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