Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans
Summary
Questo protocollo descrive come misurare la permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. Questo metodo è utile per la ricerca biologica di base sulla salute intestinale relativa all’interazione tra i batteri intestinali e il loro ospite e per lo screening per identificare gli agenti probiotici e chimici per curare la sindrome dell’intestino che perde e le malattie infiammatorie intestinali.
Abstract
Negli organismi viventi, l’iperpermescopibilità intestinale è un sintomo grave che porta a molte malattie infiammatorie intestinali (IBD). Caenorhabditis elegans è un modello animale non mammaliano che è ampiamente utilizzato come sistema di analisi a causa della sua breve durata di vita, trasparenza, convenienza e mancanza di questioni etiche degli animali. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per studiare gli effetti di diversi batteri e 3,3′-diindolylmethane (DIM) sulla permeabilità intestinale di C. elegans con un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto di velocità. I vermi sono stati infettati da diversi batteri intestinali o cotrattati con DIM per 48 h e alimentati con fluoresceinisocianate (FITC)-dextran durante la notte. Quindi, la permeabilità intestinale è stata esaminata confrontando le immagini di fluorescenza e l’intensità della fluorescenza all’interno dei corpi del verme. Questo metodo può anche avere il potenziale per identificare i batteri intestinali probiotici e patogeni che influenzano la permeabilità intestinale nel modello animale ed è efficace per esaminare gli effetti di sostanze chimiche dannose o che promuovono la salute sulla permeabilità intestinale e salute intestinale. Tuttavia, questo protocollo ha anche alcune notevoli limitazioni a livello genetico, soprattutto per determinare quali geni vengono modificati per controllare la malattia, perché questo metodo è utilizzato principalmente per la determinazione fenotipica. Inoltre, questo metodo si limita a determinare esattamente quali substrati patogeni causano infiammazione o aumentano la permeabilità dell’intestino dei vermi durante l’infezione. Pertanto, ulteriori studi approfonditi, tra cui lo studio del meccanismo genetico molecolare utilizzando batteri mutanti e nematodi, nonché l’analisi dei componenti chimici dei batteri, sono necessari per valutare completamente la funzione dei batteri e sostanze chimiche nel determinare la permeabilità intestinale.
Introduction
La permeabilità intestinale è considerata come una delle principali barriere legate al microbiota intestinale e all’immunità mucosale ed è probabile che sia influenzata da diversi fattori, come le modifiche del microbiota intestinale, la compromissione epiteliale o le alterazioni dello strato di muco1. Recenti documenti hanno riportato protocolli efficaci per misurare la permeabilità intestinale delle cellule intestinali umane coltivate analizzando i tassi di flusso di fluorescenza attraverso lo strato di cellule intestinali2, ma meno documenti di ricerca presentano una procedura adatta per misurare la permeabilità intestinale nei nematodi, in particolare in C. elegans, utilizzando la colorazione FITC-dextran.
Ci sono due protocolli rappresentativi per misurare la permeabilità intestinale in C. elegans utilizzando il rosso Nilo3 e il disodio erioglaucine (o il saggio del Puffo)4,5. In questo protocollo, abbiamo usato FITC-dextran (peso molecolare medio 10.000), che ha un peso molecolare molto più elevato rispetto al Nilo rosso (MW – 318,37) e al disodico di erioglaucine (MW – 792,85). FITC-dextran è più simile di rosso del Nilo o coloranti disodio erioglaucina ai nutrienti macromolecolari effettivi come i carboidrati, che vengono assorbiti attraverso lo strato intestinale. La permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con erioglaucine disodium (colorante Puffo blu) può essere facilmente valutata senza microscopia a fluorescenza. Tuttavia, nel saggio Puffo, l’analisi quantitativa della permeabilità intestinale è difficile a causa della mancanza di standardizzazione e dovrebbe essere valutata manualmente4,5. Nel caso del saggio rosso del Nilo, il rosso del Nilo macchia anche le goccioline lipidiche nelle cellule, che possono interferire con l’esatta determinazione della permeabilità intestinale in C. elegans6. I protocolli attuali consentono un’analisi quantitativa rapida e precisa della permeabilità intestinale in C. elegans trattati con vari batteri intestinali e sostanze chimiche evitando la colorazione lipidica non specifica.
C. elegans è un modello tipico nei campi biologici grazie al suo prezzo accessibile, alla facilità di manipolazione, alle limitate questioni etiche degli animali e alla breve durata della vita, che è vantaggioso per una rapida sperimentazione7. In particolare, dopo la pubblicazione dell’intero genoma di C. elegans, quasi il 40% dei geni nel genoma di C. elegans è risultato ortologo dei geni che causano malattie umane8. Inoltre, il corpo trasparente consente l’osservazione all’interno dell’organismo, che è vantaggioso per la ricerca di eventi cellulari e per le applicazioni di fluorescenza nella biologia cellulare, ad esempio, colorazione delle cellule staminali con DAPI o immunohistochimica9. C. elegans è spesso usato come animale sperimentale per studiare l’interazione tra il microbiota intestinale e l’ospite; inoltre, C. elegans viene utilizzato per lo screening dei batteri probiotici che promuovono la salute10,11,12 così come sostanze chimiche dietetiche promuovere la salute intestinale13,14.
Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis sono batteri intestinali ben noti che influenzano negativamente il sistema gastrointestinale, in particolare le cellule epiteliali coloniche del tratto intestinale15,16. Pertanto, misurare la permeabilità intestinale innescata da questi batteri è necessario per lo screening e lo sviluppo di nuovi farmaci che possono recuperare e ridurre i danni causati da infiammazione batterica e infezione. In questo protocollo, abbiamo testato gli effetti di questi batteri intestinali sulla permeabilità intestinale di C. elegans.
Riportiamo anche un protocollo ottimizzato per testare sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale di C. elegans. A questo scopo, abbiamo usato 3,3′-diindolylmethane (DIM) come prodotto chimico modello perché DIM è un composto di metabolita bioattivo derivato da indole-3-carbinolo, che è presente nelle piante alimentari Brassica, ed è stato segnalato per avere effetti terapeutici sull’IBD nei topi17,18. Inoltre, recentemente abbiamo scoperto che DIM migliora la disfunzione della permeabilità intestinale in entrambe le cellule intestinali umane coltivate, così come il modello nematode C. elegans19.
In questo studio, abbiamo usato tre diverse condizioni sperimentali. In primo luogo, abbiamo misurato gli effetti dei diversi batteri, P. aeruginosa ed E. faecalis, sulla permeabilità intestinale (Figura 1). In secondo luogo, abbiamo misurato gli effetti di P. aeruginosa vivo e inattivato dal calore sulla permeabilità intestinale (Figura 2). In terzo luogo, abbiamo misurato gli effetti del DIM (un modello chimico) sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con P. aeruginosa (Figura 3).
L’obiettivo di questo studio era quello di sviluppare protocolli ottimizzati che misurano la permeabilità intestinale di C. elegans, che viene modificata dal trattamento con vari batteri intestinali e con sostanze chimiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando questo nuovo metodo per determinare la permeabilità intestinale in C. elegans, che combina la microscopia a fluorescenza automatizzata e l’analisi quantitativa delle immagini, le differenze causate da microrganismi intestinali o sostanze chimiche possono essere determinate in vivo, in particolare nell’intestino di C. elegans. Questo protocollo è utile per le indagini sulla permeabilità intestinale e applicabile a molti compiti, come la determinazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca intramurale dell’Istituto coreano di scienza e tecnologia (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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