L'automazione è fondamentale per la scalabilità e la gestione dei costi nella produzione di celle. Questo manoscritto descrive l'uso di un dispositivo di elaborazione cellulare centrifuga controil flusso per automatizzare lo scambio di buffer e le fasi di concentrazione cellulare per il bioprocesso su piccola scala.
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Articolo metodologico
Sistema automatizzato di centrifuga controflusso per l'elaborazione di celle su piccola scala
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una commercializzazione efficace delle terapie geniche e basate sulle cellule richiede processi di produzione convenienti e scalabili. Lo scambio di buffer e la concentrazione dei prodotti sono componenti essenziali per la maggior parte dei processi di produzione. Tuttavia, nelle prime fasi dello sviluppo del prodotto, questi passaggi vengono spesso eseguiti manualmente. La centrifugazione manuale senza uscita senza uscita per lo scambio di buffer è laboriosa, costosa e non scalabile. Un sistema automatizzato chiuso può eliminare efficacemente questo laborioso passo, ma l'implementazione può essere difficile. Qui, descriviamo un dispositivo di elaborazione cellulare di recente sviluppo che è adatto per l'elaborazione di celle su piccola e media scala e mira a colmare il divario tra l'elaborazione manuale e l'automazione su larga scala. Questo protocollo può essere facilmente applicato a vari tipi di cellule e processi modificando la portata e la velocità di centrifugazione. Il nostro protocollo ha dimostrato un elevato recupero cellulare con tempi di elaborazione più brevi rispetto al processo manuale. Anche le cellule recuperate dal processo automatizzato hanno mantenuto i loro tassi di proliferazione. Il dispositivo può essere applicato come componente modulare in un processo di produzione chiuso per adattarsi a passaggi come lo scambio di buffer, la formulazione delle cellule e la crioconservazione.
Introduzione
Il panorama della medicina moderna si è rapidamente trasformato attraverso recenti sviluppi nelle terapie geniche e basate sulle cellule (GCT). Essendo uno dei settori in più rapida crescita nella ricerca traslazionale, anche il settore GCT si trova ad affrontare sfide uniche e senza precedenti. Oltre ai solidi risultati clinici, processi di produzione efficienti ed efficienti in termini di costi sono essenziali per il successo commerciale della GCT, che è particolarmente difficile da ottenere nella produzione su piccola scala1. Il costo del tempo, del lavoro e delle garanzie di qualità sono amplificati quando ogni lotto di cellule produce solo....
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Protocollo
1. Preparazione di reagenti e celle per lo scambio di buffer
- Preparare i buffer (vedere Tabella dei materiali) in una cappa di flusso laminare di classe 2. Utilizzando un assemblaggio di siringhe e aghi, rimuovere 50 mL di soluzione salina da un sacchetto salina da 500 mL. Sostituirlo con 50 mL di 20% di albumina di siero umano (HSA) per fare 2% HSA in salina, che servirà come buffer di lavaggio.
- Rimuovere le cellule dai vasi di coltura ed eseguire un conteggio delle cellule per determinare la quantità di celle iniziale e la vitalità dall'esclusione blu trypan. Caricare le celle in un sacchetto di trasferimento.
NOTA: in questo ....
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Risultati
In questo protocollo, abbiamo usato le celle Jurkat e MSC come esempi rappresentativi per dimostrare il processo di scambio automatico del buffer. Durante il processo, le cellule Jurkat e le MSC condividevano le stesse fasi di lavorazione con differenze di forza centrifuga e velocità di pompaggio che controllano la portata (Tabella 1). La figura 2 mostra le immagini rappresentative catturate dalla fotocamera di come può apparire il letto cellulare fluido durante il processo .......
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Discussione
Il protocollo di scambio automatico del buffer descritto è semplice e facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi chiave in questo protocollo che sono critici e richiedono particolare attenzione. Nella nostra esperienza, durante l'elaborazione di celle più grandi come MSC (diametro medio 10-15 m) ogni esecuzione dovrebbe includere almeno 1 x 107 celle per ottenere un recupero ottimale delle cellule (Figura 4B). L'elaborazione di celle più piccole, come le c.......
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Dichiarazioni
SW, IF e DJ sono COO, CTO e CEO di Scinogy Pty. Ltd. L'accesso al dispositivo CFC è stato fornito anche da Scinogy.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal programma operativo di supporto alle infrastrutture del governo vittoriano e dal voucher tecnologico del governo vittoriano fornito dal Dipartimento di Sviluppo Economico, Lavoro, Trasporti e Risorse. RL è il destinatario di una borsa di studio national Health and Medical Research Council Career Developmentship. AL ha ricevuto un Australian Postgraduate Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringhe Luer lock da 20 ml | BD | 302830 | |
| 20% albumina sierica umana (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(dimetilammino)benzaldeide | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| Sacca salina EV da 500 ml | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotico-Antimicotico | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Contatore di cellule automatizzato (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Vetrini per camera di conteggio cellulare | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cocktail di stimolazione cellulare (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Sacche per il trasferimento cellulare | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: Terreni F12 | Thermo Fisher Scientific 11320082 | ||
| Lettore di piastre EnVision | Perkin Elmer | N/A | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific 10099141 | ||
| Kit interleuchina umana 2 (IL2) | Perkin Elmer | Al221C | |
| Raccordi Luer (femmina) | CPC | LF41 | |
| PC portatile o PC tablet | ASUS | N/A | |
| Lettore di piastre (SpectraMax i3) | Dispositivo molecolare | N/A IFN | |
| umano ricombinante-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Dispositivo di elaborazione di cellule per centrifuga in controcorrente Rotea | Scinogy | N/A Kit | |
| di lavorazione monouso Rotea | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Forbici chirurgiche | ProSciTech | 420SS | |
| Acido tricloroacetico | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Tripano Colorazione Blu | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Enzima di digestione della tripsina (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
Riferimenti
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Sp....
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Ristampe e permessi
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