Automatisert motstrøm sentrifugal system for småskala celle behandling

Summary

Automatisering er nøkkelen til oppskalering og kostnadsstyring i celle produksjon. Dette manuskriptet beskriver bruken av en motstrøm sentrifugal celle prosesserings anordning for automatisering av buffer utveksling og celle konsentrasjons trinn for småskala bioprosessering.

Abstract

Vellykket kommersialisering av gen-og cellebasert behandling krever produksjonsprosesser som er kostnadseffektive og skalerbare. Buffer utveksling og produkt konsentrasjon er vesentlige komponenter for de fleste produksjonsprosesser. I de tidlige stadiene av produktutviklingen utføres imidlertid disse trinnene ofte manuelt. Manuelle Dead-End-sentrifugering for buffer utveksling er arbeidsintensiv, kostbar og ikke skalerbar. Et lukket, automatisert system kan effektivt eliminere dette arbeidskrevende trinnet, men implementeringen kan være utfordrende. Her beskriver vi en nyutviklet celle prosessering enhet som er egnet for små og mellom store celle prosessering og har som mål å bygge bro over gapet mellom manuell prosessering og stor skala automatisering. Denne protokollen kan enkelt brukes på ulike celletyper og prosesser ved å endre strømningshastighet og sentrifugering hastighet. Vår protokoll demonstrerte høy celle gjenvinning med kortere behandlingstid i forhold til den manuelle prosessen. Celler utvinnes fra den automatiserte prosessen også opprettholdt deres spredning priser. Enheten kan brukes som en modulær komponent i en lukket produksjonsprosess for å imøtekomme trinn som buffer utveksling, celle formulering og kryonisk bevaring.

Introduction

Landskapet av moderne medisin har forvandlet raskt gjennom den siste utviklingen i genet og celle-baserte terapier (GCT). Som en av de raskest voksende feltene innen translational forskning, står GCT-sektoren også overfor unike og enestående utfordringer. I tillegg til robuste kliniske utfall er effektive og kostnadseffektive produksjonsprosesser avgjørende for den kommersielle suksessen til GCT, noe som er spesielt vanskelig å oppnå i småskala produksjon¹. Kostnaden for tid, arbeid og kvalitet forsikringer er forstørret når hver gruppe av celler bare produserer noen få doser for en pasient i stedet for hundrevis eller tusenvis. I motsetning til allogene celle terapier der produksjonsprosessene er mer beslektet med produksjonen av antistoffer og rekombinant proteiner, er autologous celle terapier vanligvis produsert som småskala operasjoner¹. Som et relativt nytt fenomen i biofarmasøytisk produksjon², alternativer for småskala celle behandling er for tiden ganske begrenset.

Buffer utveksling er viktig for celle produksjon. Det er en av de nedstrøms prosesser der cellene er fjernet fra kultur Media og konsentrert for kryonisk bevaring eller infusjon. For tiden gjelder småskala celle produksjon ofte prosesser som ligner på de i akademisk forskning innstillingen og er avhengig av spesialiserte rene rom for å opprettholde sterilitet³. Manuelle nedstrøms prosesser bruker ofte stasjonære sentrifuger til pellets og resuspend celler for volumreduksjon og buffer utveksling. Disse åpne prosessene er kostbare (dvs. arbeid og ren rom vedlikehold) og har begrenset produksjonskapasitet, som ikke er ideelle for kommersiell produksjon^2,3.

Implementering av automatisering har blitt foreslått som en løsning for å forbedre produksjonseffektiviteten og oppnå kommersielle skala produksjoner². Sterilitet kan ikke oppnås i celle-baserte produkter gjennom tradisjonelle metoder som brukes for biologiske, som gamma bestråling eller Terminal end filtrering. I stedet distribueres et automatisert lukket system for å redusere risikoen for forurensning og operatører som er avhengige av rene rom for å opprettholde sterilitet⁴. Prosessautomatisering løser også problemet med skalerbarhet ved at du enten har flere systemer som kjører parallelt (skalering) eller øker Prosesseringskapasiteten til en individuell enhet (oppskalering), noe som igjen minimerer variasjonen mellom operatørene. Dessuten antyder kostnads modellerings analyse av autologous behandling at automatisering kan redusere kostnadene ved produksjon^5,6. Imidlertid ble det ikke funnet noen kostnadsfordel i en klinisk studie av autologous stamceller der en automatisert produksjonsplattform ble brukt⁷, noe som tyder på at kostnadsfordelen ved automatisering kan avhenge av den enkelte produksjonsprosessen.

Det finnes ulike strategier der automatisering kan innføres i en eksisterende produksjonsprosess. Dette kan oppnås enten ved å implementere en fullt integrert plattform eller en modulær-basert prosesskjede. Det finnes flere fullt integrerte plattformer kommersielt tilgjengelig for autologous celle produksjon, for eksempel CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (oktan Biotech), og Quantum (TERUMO BCT). Disse integrerte plattformene, som ofte beskrives som “GMP-in-a-Box”, har lave krav til infrastruktur og er enkle å betjene. Produksjonskapasiteten til et fullt integrert oppsett kan imidlertid begrenses av inkubator festet til systemet. For eksempel, den dyrking kapasitet vidunderbarn er begrenset til sin 400 ml kammer⁸ og Quantum kassetten har en begrensende areal satt til 2,1 m² (tilsvarende 120 T175 flasker)⁷, som kanskje ikke er tilstrekkelig for pasienter som krever høyere celle doser^9,10. I tillegg har Prodigy og Quantum en felles egenskap som begrenser deres bruk: den operative enheten er okkupert av en enkelt gruppe med celler i hele celle Utvidelses perioden, og dermed begrense antall partier som kan produseres av hver enhet¹¹. Den modulære tilnærmingen til automatisering er å opprette en produksjons kjede med flere modulære enheter som simulerer den kommersielle produksjonsprosessen^12,13. Denne tilnærmingen, som skiller kulturen enheten fra cellen vaskemaskin, kan dermed maksimere produksjonseffektivitet. En ideell prosesseringsenhet vil være en som er tilpasningsdyktig og skalerbar til produksjon behov¹².

Motstrøm sentrifugering (CFC) teknologi, som dateres tilbake til 1970-tallet, har hatt en lang historie i celle prosessering¹⁴. Den oppnår celle konsentrasjon og separasjon ved å balansere sentrifugalkraften med en motstrøm kraft. Vanligvis kommer en celle suspensjon fra den smale enden av en celle kammer under en konstant strømningshastighet mens utsatt for en sentrifugalkraft (figur 1a). Flyten av væsken utøves i motsatt retning av sentrifugalkraften. Dette kalles motstrøm kraft, som danner en gradient i celle kammeret. Den motstrøm kraften synker da celle kammeret utvider seg bort fra tuppen av membran-formede celle kammeret. Celler med høyere tetthet og større diameter har en høyere sedimentering hastighet, og dermed de når styrke likevekt mot spissen av kjegle-formede celle kammeret. Mindre partikler kan nå likevekt mot bunnen av kammeret eller være for liten til å bli beholdt i kammeret og vil bli vasket bort. Den CFC teknologien er mest kjent for sin anvendelse i behandling av blod aferese produkter, for eksempel isolere monocytter for dendrittiske celle terapi^15,16. Når det gjelder buffer utveksling, har CFC-teknologien bare blitt anvendt i Storskalaproduksjon¹⁷ og har ennå ikke blitt brukt for mindre skala produksjon av autologous celle terapier.

For å møte behovet for en egnet enhet for småskala celle produksjon, en automatisert CFC enhet (se tabell over materialer), ble nylig utviklet¹⁸. Det automatisert cellen bearbeiding apparat bruker motstrøm sentrifugering teknologien å fjerne cellen rusk og Letter buffer bytte. Enheten utfører buffer utveksling med en enkelt-bruk kit som kan være sterile-koblet til en celle overføring bag, som gjør at cellene skal behandles i et sterilt, lukket system. Her undersøker vi bruken av en motstrøm sentrifugal anordning for å utføre buffer utveksling i pattedyr cellekulturer i automatiserte protokoller. I denne studien, testet vi buffer utvekslings protokoll bruker Jurkat celler og mesenchymal stromal celler (MSCs) til modell nonadherent og tilhenger celletyper, henholdsvis. Jurkat celler er udødeliggjort T celler som ofte brukes til studiet av akutt T celle leukemi^19,20. MSCs er voksne stamceller som har blitt studert i Human kliniske studier for et bredt spekter av sykdommer⁹.

Protocol

1. utarbeidelse av reagenser og celler for buffer utveksling Klargjør buffere (se tabell over materialer) i en klasse 2 laminær Flow Hood. Ved hjelp av en sprøyte og nål montering, Fjern 50 mL saltoppløsning fra en 500 mL saltvanns pose. Erstatt dette med 50 mL av 20% humant serum albumin (HSA) å gjøre 2% HSA i saltvann, som vil tjene som vaskebuffer. Fjern cellene fra kultur fartøyene og utfør en celle telling for å bestemme Start celle antallet og levedyktigheten ved å tr…

Representative Results

I denne protokollen, brukte vi Jurkat celler og MSCs som representative eksempler for å demonstrere automatiserte buffer utveksling prosessen. Under prosessen delte Jurkat celler og MSCs de samme behandlingstrinnene med forskjeller i sentrifugalkraften og pumpehastigheten som styrer strømningshastigheten (tabell 1). Figur 2 viser representative bilder tatt av kameraet på hvordan fluidisert celle seng kan vises under buffer utvekslings prosessen. Vanligvis vil fluidisert c…

Discussion

Den automatiserte buffer utveksling protokollen er beskrevet er enkel og brukervennlig. Likevel er det noen viktige trinn i denne protokollen som er kritiske og krever spesiell oppmerksomhet. I vår erfaring, når du behandler større celler som MSCs (gjennomsnittlig diameter 10 – 15 μm) hver kjøre bør inneholde minst 1 x 10⁷ celler for å oppnå optimal celle utvinning (Figur 4B). Behandling av mindre celler, for eksempel Jurkat celler (gjennomsnitt ~ 10 μm…

Materials

20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013