Summary
Dit protocol maakt de optimalisatie en de daaropvolgende efficiënte generatie van nucleaire en cytoplasmatische fracties van primaire chronische lymfatische leukemie cellen. Deze monsters worden gebruikt om te bepalen van de eiwit lokalisatie, alsmede veranderingen in de handel in eiwitten die plaatsvinden tussen de nucleaire en cytoplasmische compartimenten op celstimulatie en medicamenteuze behandeling.
Abstract
De nucleaire export van macromoleculen wordt vaak gedereguleerd in kankercellen. Tumor suppressor eiwitten, zoals p53, kunnen inactief worden gemaakt als gevolg van afwijkende cellulaire lokalisatie die hun werkingsmechanisme verstoren. Het voortbestaan van chronische lymfatische leukemie (CLL) cellen, onder andere kankercellen, wordt bijgestaan door de deregulering van nucleaire tot cytoplasma, althans gedeeltelijk door deregulering van de transport receptor XPO1 en de constitutieve activering van PI3K-gemedieerde signalering trajecten. Het is essentieel om de rol van individuele eiwitten in de context van hun intracellulaire locatie te begrijpen om een dieper inzicht te krijgen in de rol van dergelijke eiwitten in de Pathobiologie van de ziekte. Bovendien zal het identificeren van processen die ten grondslag liggen aan celstimulatie en het werkingsmechanisme van specifieke farmacologische remmers, in de context van subcellulaire eiwit handel, een uitgebreider inzicht geven in het mechanisme van Actie. Het protocol beschreven hier maakt de optimalisatie en de daaropvolgende efficiënte generatie van nucleaire en cytoplasmatische fracties van primaire chronische lymfatische leukemie cellen. Deze fracties kunnen worden gebruikt om veranderingen in de eiwit handel tussen de nucleaire en cytoplasmische fracties op celstimulatie en medicamenteuze behandeling te bepalen. De gegevens kunnen worden gekwantificeerd en parallel met immunofluorescentie beelden worden gepresenteerd, waardoor robuuste en kwantificeerbare gegevens worden verschaft.
Introduction
Het transport van macromoleculen tussen de Nucleus en het cytoplasma is al lang vastgesteld om een sleutelrol te spelen in de normale cellulaire functie en wordt vaak gedereguleerd in kankercellen1,2. Een dergelijke deregulering kan het gevolg zijn van overexpressie/mutatie van eiwitten die de nucleaire export beheersen. Een van deze eiwitten Exportin-1 (XPO1), is een transport receptor die exporteert > 200 nucleair export signaal (NES)-bevattende eiwitten in het cytoplasma van de Nucleus2. XPO1-cargos omvatten p53, foxo familieleden en IB, bij te dragen aan hun inactivatie door remming van hun werkingsmechanisme1,2,3. Verdere eiwit mislokalisatie kan optreden wanneer micro-milieu signalen inkrimpen op de kankercellen, leidt tot de activering van intracellulaire signalering trajecten zoals de fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)/Akt traject, resulterend in inactivatie van foxo familieleden en daaropvolgende export uit de Nucleus4,5. Dergelijke onjuiste lokalisatie van tumor suppressor eiwitten is betrokken bij de progressie van een aantal hematologische en solide tumoren1,2,6.
De ontwikkeling van kleine molecuul remmers voor klinisch gebruik in hematologische maligniteiten (acute myeloïde leukemie (AML)/CLL), die binden aan en selectief remmen XPO1 functie, onderstreept het belang van het ontwikkelen van passende technieken om de effect van farmacologische agentia op het bekruimelen van eiwitten tussen de nucleaire en cytoplasmische compartimenten6,7,8. Beeldvormingstechnieken hebben de identificatie van eiwitten in subcellulaire compartimenten aanzienlijk verbeterd bij externe stimulatie van medicamenteuze behandelingen, maar het belang van robuuste en ondersteunende parallelle technieken is essentieel om betrouwbaar een wetenschappelijk publiek te informeren over de geldigheid van een resultaat.
Rust lymfocyten en maligne CLL-B cellen geïsoleerd van patiënt bloedmonsters vertegenwoordigen een uitdaging in de generatie van nucleaire en cytoplasmorische fracties als gevolg van de hoge nucleaire: cytoplasmische verhouding. De optimalisatie van experimentele omstandigheden voor het genereren van robuuste en betrouwbare experimentele gegevens is natuurlijk essentieel om toekomstige experimentele Programma's te plannen. De hier beschreven methode maakt kwantificering van eiwitten in de nucleaire en cytoplasmische fracties mogelijk en bepaalt hoe deze eiwitten kunnen worden beïnvloed door cellulaire stimulatie en/of medicamenteuze behandeling.
Protocol
Het gebruik van primaire monsters van CLL-patiënten die hier worden beschreven, is goedgekeurd door het westen van Schotland Research Ethics service, NHS Greater Glasgow en Clyde (UK) en alle werkzaamheden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen.
1. isolatie van CLL-cellen uit bloedmonsters van patiënten
-
Perifere bloedmonsters van eerder toegestemde CLL-patiënten worden ontvangen van de kliniek in EDTA-bloedopvangbuisjes, begeleid door het witte celgetal (WCC). Zuivert de perifere bloed CLL-monsters volgens de WCC. Voor WCC < 40 x 106 cellen/ml, ga verder naar stap 1.1.1; voor WCC ≥ 40 x 106 cellen/ml, ga verder naar stap 1.1.2.
- Giet de inhoud van alle EDTA-bloedbuizen in een conische centrifugebuis van 50 mL en voeg 50 μL humane B-Celverrijkings cocktail toe per 1 mL bloed. Incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min. Ga verder naar stap 1.1.2.
- Verdun het monster met een verhouding van 1:1 met RT CLL-reinigings buffer (fosfaatgebufferde Salin (PBS), 0,5% foetaal serum (FBS) en 2 mM EDTA).
- Met een dichtheidsgradiënt van ALIQUOT in een conische centrifugebuis van het monster (10 mL in een buis van 50 mL voor 30 mL monster of 4 mL in een buis van 15 mL voor 10 mL monster).
- Laag het monster voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiënt media en centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten bij RT.
Opmerking: Zorg ervoor dat de centrifuge op RT staat voordat de monsters in de centrifuge worden geplaatst, aangezien een verandering in temperatuur resulteert in een slechte verrijking van mononucleaire cellen en de rem op de centrifuge uitschakelt, omdat plotseling remmen de vloeistof interface kan verstoren. - Oogst voorzichtig de witte laag mononucleaire cellen die op het raakvlak van de dichtheidsgradiënt media en de CLL-reinigings buffer worden verzameld, in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 mL met behulp van een kunststof Pasteur-pipet.
- Voeg 40 mL CLL-reinigings buffer toe aan de geïsoleerde monolaag om de cellen te wassen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij RT.
- Gooi het supernatant weg, regeer de pellet door de bodem van de buis te flikken en herhaal vervolgens de wasstap die wordt beschreven in stap 1,5.
- Gooi het supernatant weg, regeer de pellet zoals beschreven in stap 1,6, en breng de pellet in een vast volume CLL-wasbuffer (tot 40 mL, afhankelijk van de grootte van de celpellet).
- Tel de cellen met trypan Blue en een hemocytometer. Ga vervolgens naar flow flowcytometrieonderzoeken om de zuiverheid van CLL cellen te controleren.
Opmerking: In dit stadium kunnen de CLL-cellen worden gekweekt in een concentratie van 10 x 106 cellen/ml in media om te worden gebruikt in experimenten, en/of cryopreserved in 10% dimethylsulfoxide (DMSO)/FBS voor toekomstig werk bij concentraties van maximaal 100 x 106 cellen/injectieflacon.
2. Flowcytometrie van CLL-cellen
- Etiket 12 mm x 75 mm ronde bodem polystyreen buizen zoals beschreven in tabel 1.
- In tubes 2 – 5, zet een druppel compensatie kralen en bewaar op ijs. Voeg 1 μL van het geschikte antilichaam (anti-CD5, CD19, CD23 of CD45, zoals aangegeven in tabel 1) toe aan buisjes 2 – 5, en incuberen op ijs gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht door het aanbrengen van tin folie over de ijsemmer.
Opmerking: Deze buizen fungeren als compensatie controles voor het instellen van de flow flowcytometrieonderzoeken sjabloon. -
Zet tot 1 x 106 CLL-cellen in buizen 1, 6 en 7, voeg 2 ml FACS buffer (PBS + 2% FBS) toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te wassen. Gooi het supernatant weg en bewaar de buisjes met celpellets op ijs.
- Respendeer de celpellets en voeg de juiste combinatie van antilichamen toe aan de cellen in buis 7 volgens de instructies in tabel 1, in een eindvolume van 100 ΜL met FACS buffer. Antilichamen worden gebruikt in een geschikte concentratie volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Respendeer de celpellets in buisjes 2 en 6 in 100 μL FACS buffer.
- Inbroed de cellen op ijs, naast de gekleurde kralen in buisjes 2 – 5, beschermd tegen licht gedurende 20 minuten.
- Na de incubatie, voeg 2 mL FACS buffer toe aan alle buisjes en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te wassen. Gooi de supernatant weg en regeer de kraal/celpellets door zachtjes de buisjes te flikken.
- Respendeer buizen 1-5 in 100 μL FACS buffer en plaats op ijs tot klaar om te analyseren op de flow cytometer.
- Verdun de DAPI-oplossing onmiddellijk vóór gebruik tot 0,05-0,2 μg/mL in de FACS-buffer. De optimale concentratie kan variëren en titratie wordt aanbevolen.
- Respendeer buizen 6 en 7 met 100 μL verdunde DAPI-oplossing en inincuberen de buisjes op ijs gedurende minimaal 5 minuten om de cellen te laten vlekken.
Opmerking: Verder wassen is niet nodig omdat DAPI aanwezig moet zijn in de buffer van dode cellen om geëtiketteerd te blijven. Zodra DAPI is toegevoegd, moeten cellen worden geanalyseerd op de flow-cytometer binnen 4 uur. - Analyseer cellen met behulp van een flow cytometer.
3. bereiding van Subcellulaire fracties uit CLL-cellen
Opmerking: Bij het plannen van de experimentele opstelling, omvatten een goed van niet-gestimuleerde/onbehandelde cellen waaruit het hele celextract kan worden gegenereerd.
- Voer de gewenste stimulatie en/of medicamenteuze behandeling van de MEC1 CLL-cellijn of geïsoleerde primaire CLL-cellen uit met 10 – 20 x 106 cellen/conditie. Cellen worden vervolgens gebruikt voor subcellulaire fractionering (stappen 3,4 & 3,5) of voor het genereren van hele celextract (stap 3,6).
- Bereiding van de oplossingen/buizen: Bereid alle oplossingen/buffers vers op de dag van de fractionering, voordat de cellen worden geoogst. Bewaar de oplossingen op ijs tot het nodig is en gebruik deze binnen 4 uur na bereiding.
- PBS/fosfatase inhibitor oplossing: bereid de fosfatase remmers in PBS door verdunning van de fosfatase remmers 1:20 in 1x PBS (d.w.z. 0,5 mL fosfatase remmers in 9,5 mL 1x PBS).
Opmerking: Zorg ervoor dat de fosfatase remmers niet zijn neergeprecipiteerd. Als er een neerslag aanwezig is, verhit tot 50 °C gedurende 10 min. - Hypotone buffer: bereid 1x hypotone buffer door het maken van een 1:10 verdunning van 10x hypotone buffer in gedistilleerd water (d.w.z. 50 μL van 10x hypotone buffer in 450 μ L van dH2O).
- 10 mm dithiotreïtol (DTT): bereid 10 mm DTT voor door een 1:100 verdunning van 1M DTT te maken met gedestilleerd water (d.w.z. 10 μL van 1 M DTT in 990 μL DH2O).
Opmerking: DTT is zeer labiele dus bereid dit vers elke keer. Vermijd herhaalde Vries/ontdooien cycli. - Volledige lysisbuffer: Bepaal hoeveel buffer vereist is voor elk experiment. Voor elk monster is 50 μL volledige lysisbuffer nodig, dus voeg 5 μL 10 mM DTT (stap 3.2.3) toe aan 44,5 μL lysisbuffer en voeg vervolgens 0,5 μL proteaseremmer-cocktail toe. Dit bedrag kan worden opgeschaald, afhankelijk van het aantal monsters in het experiment.
- Label vier sets van 1,5 mL microfugebuis buizen voor elke stimulatie en/of medicamenteuze behandeling voor de vers gestimuleerde cellen (stap 3,3), de vers gegenereerde cytoplasmische fracties (stap 3.4.3), de vers gegenereerde kern fracties (stap 3.5.3), en de hele cel eiwitlysaten (stap 3.6.3). Pre-chill deze microfugebuis tubes op ijs tot het nodig is.
- PBS/fosfatase inhibitor oplossing: bereid de fosfatase remmers in PBS door verdunning van de fosfatase remmers 1:20 in 1x PBS (d.w.z. 0,5 mL fosfatase remmers in 9,5 mL 1x PBS).
- Breng de cellen over in individueel gelabelde 1,5 mL microfugebuis buisjes en pellet door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatant en rebreng de cellen in 1 mL ijskoude PBS/fosfatase remmers (stap 3.2.1). Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatant en houd de celpellets op ijs.
- Bereiding van cytoplasmische fracties: Breng de celpellets voorzichtig over om te worden gebruikt voor subcellulaire fractionering in 50 μL van 1x hypotone buffer (stap 3.2.2). Incuberen de cellen op ijs gedurende 15 minuten om de cellen te laten zwellen.
Opmerking: Het volume van de gebruikte hypotone buffer kan empirisch worden verhoogd, afhankelijk van het celnummer.- Voeg 0,8-2,5 μL (1:20 tot 1:60) afwasmiddel toe aan elk monster en Vortex op de hoogste instelling voor 10 sec.
- Om te bepalen van de optimale concentratie van detergens te gebruiken voor een specifiek celtype te isoleren van nucleaire en cytoplasmorische fracties, voer een wasmiddel gradiënt in eerste instantie. Een bereik van 1:20 tot 1:60 (d.w.z. 2,5 μL tot 0,8 μL afwasmiddel in 50 μL hypotone buffer) moet toereikend zijn.
Opmerking: als het volume van de hypotone buffer in stap 3,4 wordt aangepast, zorg dan dat de juiste reinigings verhouding gehandhaafd blijft. - Verifieer cellysis door cellen te observeren met behulp van een fasecontrastmicroscoop voor en na toevoeging van wasmiddel. Hele cellen lijken groter met een dichte, donkere kern. Het cytoplasma zal verschijnen als een heldere Halo rond de Nucleus.
Opmerking: Geschikte lysis wordt verder bevestigd door het gebruik van Western blotting om specifieke eiwitten te analyseren binnen de gelyseerd fracties gegenereerd uit het wasmiddel gradiënt.
- Om te bepalen van de optimale concentratie van detergens te gebruiken voor een specifiek celtype te isoleren van nucleaire en cytoplasmorische fracties, voer een wasmiddel gradiënt in eerste instantie. Een bereik van 1:20 tot 1:60 (d.w.z. 2,5 μL tot 0,8 μL afwasmiddel in 50 μL hypotone buffer) moet toereikend zijn.
- Centrifugeer na het lysed de monsters bij 14.000 x g gedurende 30 sec. bij 4 °c.
- Breng het supernatant voorzichtig over in een voorgekoeld, gelabeld microfugebuis buisje. Deze cytoplasmische fractie kan worden opgeslagen bij-80 °c totdat nodig voor verdere analyse. De overblijvende pellet bevat de nucleaire fractie (stap 3,5).
Opmerking: Vermijd herhaalde vries/dooi cycli van de monsters.
- Voeg 0,8-2,5 μL (1:20 tot 1:60) afwasmiddel toe aan elk monster en Vortex op de hoogste instelling voor 10 sec.
- Bereiding van kern fracties: Respendeer elke nucleaire pellet in 50 μL complete lysisbuffer (stap 3.2.4) door op en neer te pipetteren.
Opmerking: Het volume van de volledige lysisbuffer kan empirisch worden aangepast volgens het startcel nummer.- Voeg 2,5 μL afwasmiddel toe om eiwitten die zijn geassocieerd met het nucleaire membraan en de Vortex op de hoogste instelling voor 10 s te solubiliseren. Incubeer de monsters op ijs gedurende 30 minuten.
- Vortex op de hoogste stand voor 30 s, vervolgens Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
- Breng het supernatant over in een voorgekoeld, gelabeld microfugebuis buisje. Deze nucleaire fractie kan worden opgeslagen bij-80 °c tot het nodig is voor verdere analyse.
Opmerking: Vermijd herhaalde vries/dooi cycli van de monsters.
- Bereiding van hele cellysaten (WCL) uit CLL-cellen
Opmerking: De bereiding van het hele celextract kan tegelijkertijd met de bereiding van de nucleaire fracties worden uitgevoerd (stap 3,5).- Breng de volledige celextract pellets in 100 μL complete lysisbuffer (bereid in stap 3.2.4) door met pipetteren op en neer, voeg vervolgens 5 μL afwasmiddel toe om volledige cellyse te garanderen. Incuberen de monsters op ijs gedurende 30 minuten.
- Vortex op de hoogste stand voor 30 s, vervolgens Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
- Breng het supernatant over in een voorgekoeld microfugebuis buisje. Dit hele celllysaat kan worden bewaard bij-80 °c tot het nodig is voor verdere analyse.
Opmerking: Vermijd herhaalde vries/dooi cycli van de monsters.
4. downstreamanalyse van Subcellulaire fracties
Opmerking: In dit protocol werd analyse van de gegenereerde celfracties uitgevoerd door Western blotting met behulp van standaardprotocollen, het laden van gelijke celaantallen/rijstrook (equivalent aan ~ 10 μg eiwit) voor nucleaire en cytoplasmorische fracties.
- Kwantificering van de eiwit handel tussen nucleaire en cytoplasmische fracties: Voer kwantitatieve analyse van westerse Blot uit door kwantatie van de signaalintensiteit of densitometrie met behulp van vrij beschikbare Western Blot-analyse software.
- Afbeeldingen importeren: Afbeeldingen van Western Blot die zijn gegenereerd op basis van verschillende ontwikkelingsinstrumenten, moeten worden geïmporteerd als JPG-, PNG-of TIFF-bestanden. Een 16-bits diepte-RAW-bestand wordt aanbevolen. Als u een afbeelding wilt importeren, klikt u op het pictogram Software en plaatst u de muisaanwijzer op importeren. Klik vervolgens op afbeeldingen van derden. Selecteer het afbeeldingsbestand en klik op openen.
- De afbeelding wordt weergegeven: Klik in het lint afbeelding op de knop kiezen in de groep weergeven . Het dialoogvenster weergave aanpassen wordt geopend om indien nodig verdere aanpassingen mogelijk te maken. Implementeer extra verbeteringen, waaronder helderheid of contrast met behulp van de instelbare schuifregelaars op het tabblad afbeelding Luts . gebruik het tabblad curven voor fijnere aanpassingen.
- Gegevensanalyse (kanaal deselectie): Klik op het lint analyse. Als u slechts één kanaal wilt analyseren, deselecteert u de kanaal (en) die niet worden geanalyseerd. Klik op de miniatuur van een kanaal niet tonen in de afbeelding LUTs, waardoor alleen het gewenste kanaal wordt weergegeven. Voor afbeeldingen die zijn geïmporteerd als JPG-, PNG-of TIFF-bestanden kan een selectie van meerdere ongewenste RGB-kanalen nodig zijn.
-
Vormen toevoegen: Als u de signaalintensiteit wilt kwantificeren, klikt u op rechthoek toevoegen om een rechthoek aan de afbeelding toe te voegen. Klik op het midden van een object (bijvoorbeeld een proteïne band) om er een rechthoek omheen te plaatsen. Als u een vorm handmatig wilt tekenen, kiest u rechthoek tekenen. Nadat u alle gewenste shapes hebt toegevoegd, klikt u op selecteren om de cursor terug te keren naar het selectiegereedschap.
Opmerking: Voeg meerdere shapes toe in een logische volgorde, omdat de gegevens worden gesorteerd op een ID-nummer dat opeenvolgend wordt gegenereerd. -
Achtergrond aftrekken: Als u achtergrondruis wilt aftrekken, klikt u op de eerste knop in de achtergrond groep en selecteert u mediaan in het vervolgkeuzemenu. Stel de randbreedte in op 3 in de achtergrond dialoog en selecteer de segmenten die u wilt gebruiken voor de achtergrond berekening. Wanneer u kiest welke segmenten u wilt gebruiken, selecteert u segmenten die de achtergrond van de afbeelding het beste vertegenwoordigen.
Opmerking: Achtergrondruis kan de signaal kwantificering beïnvloeden, dus het moet worden afgetrokken om nauwkeurig het signaal van de vormen van belang te berekenen. -
Trim signaal en trim achtergrond-optioneel: Bestanden die zijn geïmporteerd in JPG-, PNG-of TIFF-indeling vertonen mogelijk pixel verzadiging: gemarkeerde/heldere gebieden binnen een eiwit band. Trim signaal en Trim achtergrond (bkgnd) verwijdert verzadigde pixels uit de analyse. Om deze waarden te bekijken, Voeg Trim signaal en Trim bkgnd aan een tabel door te klikken op de Columns knop rechts van de tabel weergave.
Opmerking: Pixel verzadiging kan leiden tot onbetrouwbare kwantificering. Verzadigde pixels kunnen alleen worden verwijderd als minder dan 5% van de pixels in een vorm verzadigd zijn.
-
Vormen toevoegen: Als u de signaalintensiteit wilt kwantificeren, klikt u op rechthoek toevoegen om een rechthoek aan de afbeelding toe te voegen. Klik op het midden van een object (bijvoorbeeld een proteïne band) om er een rechthoek omheen te plaatsen. Als u een vorm handmatig wilt tekenen, kiest u rechthoek tekenen. Nadat u alle gewenste shapes hebt toegevoegd, klikt u op selecteren om de cursor terug te keren naar het selectiegereedschap.
- Gegevens exporteren: Klik op het tabblad vormen boven de tabel. Voor densitometrie zijn waarden in de kolom signaal vereist. Signaal is de som van de pixel intensiteitswaarden (totaal) voor een vorm minus het product van de Bkgnd en het gebied. Klik op de knop rapport. Klik op Opslaan als of Start spreadsheet.
Signaal = totaal – (Bkgnd x gebied)
Opmerking: Het tabblad shapes bevat een tabel met kwantitatieve waarden, waaronder signaal, totaal, gebied en Bkgrnd. - Kwantificerende eiwit uitdrukking: Bereken in de opgeslagen spreadsheet de genormaliseerde uitdrukking van het eiwit van belang voor elke rijstrook of variabele door het verkregen signaal voor het eiwit van belang te delen door het signaal voor de corresponderende proteïne-ladings controleband.
Opmerking: Vergelijkingen tussen de bedragen van een genormaliseerd eiwit van belang over nucleaire en cytoplasmorische fracties kunnen niet direct worden vergeleken vanwege de verschillende laden controles gebruikt om te onderscheiden van nucleaire en cytoplasmorische fracties. Vergelijkingen binnen afzonderlijke fracties, bijvoorbeeld na medicamenteuze behandeling, zijn echter geschikt. - Afbeelding exporteren voor publicatie of presentatie: Klik op het tabblad afbeeldingen dat boven de tabel is gevonden en klik vervolgens op de afbeelding die u wilt exporteren. Als u de afbeelding voor een diapresentatie of andere digitale indelingen gebruikt, klikt u op het softwarepictogram, plaatst u de muisaanwijzer op exporteren en klikt u op afbeelding voor digitale media. Sla de afbeelding op als een JPG-, PNG-of TIFF-bestand, indien nodig.
Representative Results
Bij het plannen van experimenten op primaire CLL cellen, als assays vereisen een groot aantal cellen (> 50 x 106 cellen), er is een voorkeur voor het gebruik van vers geïsoleerde CLL cellen, in plaats van cryopreserved cellen die moeten ontdooien, maar dit is niet altijd Mogelijk. Dit is omdat het bevriezen/ontdooien proces kan resulteren in de dood van maximaal 50% van de CLL-cellen, hoewel dit monster afhankelijk is. Verrijking van CLL-cellen met een WCC > 40 x 106/ml met behulp van dichtheids centrifugeren zoals hier beschreven (stappen 1,3 – 1,5) maakt een hoog celherstel mogelijk met een hoge zuiverheid (≥ 95%) van primaire CLL-cellen. In het getoonde voorbeeld, de WCC = 177 x 106/ml: uit een 30 ml bloedmonster 5 x 109 cellen werden teruggewonnen, wat een celopbrengst van 94% van de totale cellen vertegenwoordigt. Analyse van dit monster doorstroming cytometrie onthulde een zuiverheid van CLL-cellen van > 95%, zoals aangegeven door de dubbele oppervlakte expressie van CLL-celmarkeringen CD19 en CD5 na gating op FSC/SSC, enkelvoudige cellen die DAPI-negatief waren (levensvatbare cellen) (Figuur 1).
Optimalisatie van de subcellulaire fractionering procedure werd uitgevoerd met behulp van een reeks van detergenten verhoudingen (1:20 aan 1:60) tijdens de bereiding van de cytoplasmische fractie (stap 3,4). Daarna werden de nucleaire fracties en de WCLs voorbereid (respectievelijk de stappen 3,5 en 3,6). Immunoblots werden uitgevoerd op de resulterende fracties van de CLL-cellijn MEC1 (Figuur 2A) en primaire CLL-cellen (Figuur 2B). De blots werden geprotesteerde voor de breuk markers Lamin A/C (nucleair; 74/63 kDa) en β-tubulin (Cytoplasmic; 55 kDa) om succesvolle celfractionering te bevestigen. De fractionering geeft aan dat het optimale reinigingsmiddel voor MEC1 cellen een verdunning 1:60 (Figuur 2a) is, vergeleken met een 1:30-verdunning die optimaal is voor primaire CLL-cellen (Figuur 2B), zoals aangegeven door een verrijking van nucleair eiwit en een gebrek aan cytoplasmisch eiwit in de fracties en omgekeerd. WCLs representeren het totale eiwit en fungeren als een positieve controle op antilichamen die worden gebruikt om de subcellulaire fracties te controleren. Het is belangrijk om geschikte eiwitten te kiezen als breuk Markeringen: Figuur 2C toont immunoblots van nucleaire/cytoplasmorische fracties bereid uit MEC1 cellen waarin RNA polymerase II (Rpb1 CTD; 250 kDa) en Lamin A/c werden uitgewist als markers van kern fracties, terwijl β-tubulin en γ-tubulin (50 kDa) werden gebruikt als cytoplasmische markers. Het is duidelijk dat γ-tubulin is verrijkt in het cytoplasma, maar expressie is duidelijk in de Nucleus, zoals eerder weergegeven9.
Zodra de experimentele omstandigheden zijn geoptimaliseerd, kan een experiment worden uitgevoerd. In de getoonde voorbeelden werd de subcellulaire lokalisatie van FOXO1 in nucleaire en cytoplasmische fracties bepaald bij stimulatie van cellen met de B cell antigen receptor (BCR) in de aanwezigheid of afwezigheid van de dubbele mTORC1/2-remmer AZD8055, in MEC1 cellen ( Figuur 3A) en primaire CLL-cellen (Figuur 3B)5,10. In beide voorbeelden werd de generatie van sterk verrijkte nucleaire en cytoplasmische fracties bereikt, zoals aangegeven door de bijna exclusieve uitdrukking van Lamin in de nucleaire Fractie en β-tubulin in de cytoplasmische fracties. In beide celtypen, FOXO1 expressie werd verlaagd in het cytoplasma na behandeling met AZD8055 in vergelijking met NDC, gepaard met een toename van FOXO1 uitdrukking in het nucleaire compartiment, dus aantonen van eiwit translocatie (Figuur 3). Om de subjectiviteit van de interpretatie van gegevens te verwijderen, werden individuele immunoblots van vijf primaire CLL-monsters gekwantificeerd binnen subcellulaire fracties (stap 4; Figuur 4A), met behulp van de respectieve nucleaire of cytoplasmische eiwitten als interne laden controles voor elk monster, en vervolgens normaliseren elke fractie aan de ongestimuleerd (VS) geen Drug Control (NDC) controle, zoals aangegeven. De resulterende grafiek toont trends van FOXO1 beweging tussen de nucleaire en cytoplasmische fracties, met AZD8055 het verminderen van de niveaus van FOXO1 expressie in het cytoplasma, terwijl gelijktijdig toenemende expressie in de Nucleus. Bovendien, een verhoging in cytoplasmatische FOXO1 expressie is duidelijk op BCR crosslinking.
| Buis | Naam Tube | Cellen/kralen | Antigeen | De |
| 1 | Ongekleurde ongefixeerde | Cellen | NA | NA |
| 2 | Enkele vlek | Kralen | CD5 | Fitc |
| 3 | Enkele vlek | Kralen | CD19 | PE-Cy7 |
| 4 | Enkele vlek | Kralen | CD23 | Apc |
| 5 | Enkele vlek | Kralen | CD45 | APC-Cy7 |
| 6 | Enkele vlek | Cellen | Levensvatbaarheid | DAPI |
| 7 | CLL vlek | Cellen | CD5, CD19, CD23, CD45 & levensvatbaarheid | FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 & DAPI |
Tabel 1: tabel met de ideale set van monsterbuisjes die nodig zijn voor Flowcytometrie van CLL-cellen. Elk experiment moet alle passende controles bevatten voor een nauwkeurige analyse van de verkregen resultaten.
Figuur 1: representatieve Flowcytometrie analyse plot van verrijkte CLL-patiënten. Mononucleaire-CLL-cellen die zijn verrijkt met het perifere bloed van een individuele CLL-patiënt, werden afgesloten met behulp van FSC-A VS. SSC-a, en de doubleten werden vervolgens uitgesloten met behulp van FSC-a versus FSC-H (A). Onbevlekte cellen (buis 1) en compensatie regelaars (buizen 2-6) werden gebruikt om de flow cytometer in te stellen om cellen te detecteren en te compenseren tussen de fluorescentie kanalen, zodat de fluorescerende signalen correct werden gedetecteerd. B) een voorbeeld van negatieve kleuring (Onbevlekte cellen; buis 1) in de CD19 en CD5 fluorescentie kanalen. Live (DAPI Negative) en CD45 positieve cellen werden gated (C) en de verhouding van CD19+CD5+ (95,5%) en CD19+CD23+ (91,2%) cellen binnen de DAPI-CD45+ populatie werd bepaald (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: optimalisatie van nucleaire/cytoplasmorische fractionering. Cytoplasmische en nucleaire fracties, en hele cellysaten (WCL), werden bereid uit celpellets (10 – 20 x 106 cellen) van de CLL-cellijn (A) MEC1 of (B) primaire CLL-cellen verrijkt met het perifere bloed van patiënten zoals beschreven in Stap 3. Optimalisatie van de subcellulaire fractionering werd uitgevoerd met behulp van een reeks detergenten verhoudingen (1:20 aan 1:60) bij de bereiding van de cytoplasmische fractie (zoals beschreven in stap 3,4). De resulterende monsters waren immunoblotted en doorzochte met anti-Lamin a/C (nucleaire) en anti-β-tubulin (cytoplasmische) antilichamen om succesvolle celfractionering naast wcl te bevestigen. Markeringen van moleculair gewicht worden links van de Blot (M) weergegeven. * geeft de optimale reinigings condities aan voor cellyse. C) immunoblot van nucleaire en cytoplasmorische fracties uit MEC1 cellen met controle omstandigheden (NDC) of medicamenteuze behandeling (8055) in aanwezigheid van afwezigheid van stimulatie (respectievelijk + of – BCR crosslinking). Blots werden geprobed met anti-Rbp1 CTD (kloon 4h8; herkenning van RNA polymerase II subeenheid B1), anti-Lamin A/C, anti-β-tubulin of anti-γ-tubulin (Clone gtu-88) antilichamen, om subcellulaire fracties te identificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: subcellulaire fractionering toont de pendelen van FOXO1 tussen de Nucleus en cytoplasma in CLL. A) MEC-1-cellen en (B) primaire CLL-cellen werden voorbehandeld gedurende 30 minuten met 100 nm AZD8055 (8055) of onbehandeld (NDC) zoals aangegeven en vervolgens werd BCR voor 1 uur GELIGD of ons gelaten. Nucleaire en cytoplasmorische fracties werden vervolgens bereid en immunoblotted. Na de bevestiging van fractionering door het indringende met anti-Lamine a/C (nucleaire) en anti-β-tubuline (Cytoplasmic) antilichamen, het effect van zowel medicamenteuze behandeling en BCR ligatie werd beoordeeld op FOXO1 eiwit expressie, met behulp van een anti-FOXO1 antilichaam. M geeft de moleculaire gewichts markering aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: een uitgewerkt voorbeeld van kwantitatieve westerse Blot-analyse (densitometrie). (A) densitometrie werd uitgevoerd met behulp van Western Blot Analysis software online beschikbaar. Kort, binnen de analyse lint, rechthoeken werden getekend rond eiwit bands in de afbeelding om de signaalintensiteit te berekenen. Afgebeeld is densitometrie van een representatieve Western Blot beeld van een CLL patiënt monster dat cytoplasma/nucleaire fractionering onderging. Cytoplasma en nucleaire fracties onderscheiden zich door de uitdrukking van cytoplasmatische (β-tubulin) en nucleaire (Lamin A/C) markers. Genormaliseerde expressie van FOXO1 voor een bepaalde voorwaarde kan worden berekend door het signaal dat is verkregen voor FOXO1 te delen door het corresponderende signaal voor β-Tubulin of Lamin A/C, afhankelijk van de Fractie die wordt geanalyseerd. Relatieve FOXO1 expressie (ten opzichte van de Amerikaanse voertuigbesturing), kan worden berekend door de genormaliseerde FOXO1 uitdrukking van een bepaalde voorwaarde te delen door de genormaliseerde FOXO1 uitdrukking van de Amerikaanse voertuigcontrole van een bepaalde cellulaire fractie. (B) grafiek met de FOXO1 expressieniveaus in het cytoplasmatische (links) of nucleaire (rechts) fracties genormaliseerd naar US-NDC controle binnen elke cellulaire fractie. De rode stip op de grafiek wordt het bewerkte voorbeeld getoond. Deze gegevens toont de gemiddelde vouw verandering in FOXO1 uitdrukking in vergelijking met US-NDC ± SEM. P waarden werden bepaald door tweezijdige studenten gekoppeld t test. n = 5 afzonderlijke CLL-Patiëntenmonsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Het beschreven protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het genereren van nucleaire en cytoplasmorische fracties uit primaire CLL-cellen, en daaropvolgende kwantificering van de eiwit handel tussen de nucleaire en cytoplasmische fracties op celstimulatie en medicamenteuze behandeling. De gepresenteerde gegevens tonen de mogelijkheid om de handel in specifieke eiwitten te detecteren, bijvoorbeeld FOXO1, tussen de nucleaire en cytoplasmische fracties, na behandeling met een dubbele mTOR-remmer AZD8055 in de aanwezigheid/afwezigheid van BCR crosslinking via F ( AB ')2 fragment stimulatie (Figuur 3 en Figuur 4). Door deze experimenten te koppelen aan de kwantificering van westerse blots van individuele CLL-patiënt monsters, kunnen objectieve analyses van de gegenereerde gegevens worden gemaakt en wordt de robuustheid aangetoond van de test die wordt beschreven om globale veranderingen in de eiwit lokalisatie te kwantificeren in CLL-cellen geïsoleerd van patiënt cohorten (Figuur 4). Het is duidelijk uit de gegevens dat een gemiddelde van vijf patiënt monsters in de cytoplasmische fracties in de buurt van betekenis bereikt. Gezien de klinische heterogeniteit van CLL-patiënten11, zouden deze analyses gewoonlijk worden uitgevoerd op grotere patiënt cohorten en/of gericht zijn op specifieke prognostische subgroepen van patiënten om een vollediger inzicht te krijgen in de cellulaire respons van CLL cellen tot specifieke medicamenteuze behandelingen.
De gepresenteerde gegevens tonen het belang van het kiezen van eiwit markers die uitsluitend in ofwel het cytoplasma of nucleaire fracties wonen, als de zuiverheid van de fractionering zal worden bevestigd door deze markers. β-tubulin werd gekozen voor de cytoplasmische fractie bevestiging, en Lamin A/C als een nucleaire marker. Extra eiwitten die vaak worden gebruikt, zijn gapdh en α-tubulïne om de cytoplasmische fractie of Brg1 (SMARCA4), tfiid en RNA polymerase II voor de zuiverheid van de nucleaire fractie4,5te identificeren. Echter, zorg moet worden genomen bij het kiezen van eiwitten die sterk zijn verrijkt in specifieke fracties, en niet aanwezig in beide fracties (bv. γ-tubulin) (Figuur 2C)9. Inderdaad, gapdh en actine terwijl algemeen beschouwd als cytoplasma eiwitten kunnen lokaliseren naar de Nucleus12,13, benadrukken het belang van het kiezen van een fractie marker die niet verhuizen wanneer stimulatie of behandeling is toegepast op de cellen. Bovendien is het belangrijk om te bevestigen dat de gekozen eiwit marker in de cel van belang wordt uitgedrukt door de WCL naast de subcellulaire fractionaties uit te voeren.
In het representatieve experiment getoond, werd hetzelfde aantal CLL cellen gebruikt voor elke aandoening (stimulatie/medicamenteuze behandeling), en daarna werden de fractionering monsters onmiddellijk bereid. Het laden van 10 μg gefractioneerde eiwitten/rijstrook biedt voldoende materiaal voor de detectie van de eiwitten van belang. Aangezien deze monsters slechts een korte-termijn medicamenteuze behandeling en stimulatie (tot 4 uur) onderging, werd aangenomen dat het eiwitgehalte in elk monster hetzelfde zou blijven en werd er geen eiwit test uitgevoerd. Als de celbehandelingen echter worden verlengd (18-72 uur), kan het niveau van celdood of proliferatie in cellen de kwaliteit en hoeveelheid van het geëxtraheerde eiwit significant veranderen, afhankelijk van de toegepaste drug/celstimulatie, waardoor de eiwit spiegels in de behandelde /gestimuleerde monsters. In deze gevallen voor langdurige medicamenteuze behandelingen is het raadzaam om eiwit kwantificering uit te voeren met behulp van een Bradford-assay of gelijkwaardig, voorafgaand aan Western-blotting om te zorgen dat dezelfde hoeveelheid eiwit wordt uitgevoerd in elke rijstrook van de immunoblot. De aanwezigheid van detergenten kan interfereren met specifieke proteïne-testen14, deze interferentie kan worden verminderd door het verdunen van celfractie eiwit monsters. Gebruik bovendien de volledige lysisbuffer als blanco, met dezelfde verdunning als in de monsters die worden getest.
Om ondersteunend bewijs te leveren voor de hier beschreven bevindingen, kunnen parallelle experimenten worden uitgevoerd met behulp van fluorescentiemicroscopie om de locatie van FOXO1 binnen CLL-cellen te analyseren om visualisatie van deze bevindingen5mogelijk te maken. Bovendien kunnen de gegenereerde subcellulaire fracties ook worden gebruikt voor enzymactiviteit-assays of proteomica-analyse in verdere downstream-analyses.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Natasha Malik bedanken voor het kritisch herzien van het manuscript. Deze studie werd gefinancierd door een Bloodwise projectsubsidie toegekend aan AMM (18003). FACS analyse faciliteiten werden gefinancierd door de Howat Foundation. MWM werd gefinancierd door een PhD studentship van Friends of Paul O'Gorman leukaemia Research Centre, JC werd gefinancierd door de Friends of Paul O'Gorman leukaemia Research Centre en JH werd gefinancierd door een Bloodwise project Grant (18003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
| 3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
| 12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
| 15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
| 50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
| anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
| anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
| anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
| anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
| anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
| anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
| anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
| anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
| anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
| anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
| BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
| Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
| HyperPAGE 10 - 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
| Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
| Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
| Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
| OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
| Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
| PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
| Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
| Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge | |
References
- Kau, T. R., Way, J. C., Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nature Reviews Cancer. 4, 106-117 (2004).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer. Biochemical Pharmacology. 83, 1021-1032 (2012).
- Nakamura, N., et al. Forkhead transcription factors are critical effectors of cell death and cell cycle arrest downstream of PTEN. Molecular and Cellular Biology. 20, 8969-8982 (2000).
- Calnan, D. R., Brunet, A.
- Cosimo, E., et al. AKT/mTORC2 inhibition activates FOXO1 function in CLL cells reducing B cell receptor-mediated survival. Clinical Cancer Research. 25, 1574-1587 (2019).
- Mahipal, A., Malafa, M. Importins and exportins as therapeutic targets in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 135-143 (2016).
- Hing, Z. A., et al. Next-generation XPO1 inhibitor shows improved efficacy and in vivo tolerability in hematological malignancies. Leukemia. 30, 2364-2372 (2016).
- Lapalombella, R., et al. Selective inhibitors of nuclear export show that CRM1/XPO1 is a target in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 120, 4621-4634 (2012).
- Hořejší, B., et al. Nuclear γ-tubulin associates with nucleoli and interacts with tumor suppressor protein C53. Journal of Cellular Physiology. 227, 367-382 (2012).
- McCaig, A. M., Cosimo, E., Leach, M. T., Michie, A. M. Dasatinib inhibits B cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia but novel combination approaches are required to overcome additional pro-survival microenvironmental signals. British Journal of Haematology. 153, 199-211 (2011).
- Fischer, K., Hallek, M. Optimizing frontline therapy of CLL based on clinical and biological factors. Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2017, 338-345 (2017).
- Butera, G., et al. Regulation of autophagy by nuclear GAPDH and its aggregates in cancer and neurodegenerative disorders. International Journal of Molecular Sciences. 20, 2062 (2019).
- Virtanen, J. A., Vartiainen, M. K. Diverse functions for different forms of nuclear actin. Current Opinion in Cell Biology. 46, 33-38 (2017).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).
