Aumento de la durabilidad de cultivos de células neurales disociadas utilizando matriz coralina biológicamente activa
Summary
El cultivo celular disociado del hipocampo es una herramienta experimental fundamental en neurociencia. La supervivencia y función de las células neuronales en cultivo se mejora cuando los esqueletos coralinos se utilizan como matrices, debido a sus funciones neuroprotectoras y neuromoduladoras. Por lo tanto, las células neuronales cultivadas en la matriz coralina muestran una mayor durabilidad y, por lo tanto, son más adecuadas para el cultivo.
Abstract
Los cultivos de células neuronales y gliales disociadas del hipocampo son un modelo experimental valioso para estudiar el crecimiento y la función neuronal, ya que proporcionan un alto aislamiento celular y un entorno controlado. Sin embargo, la supervivencia de las células del hipocampo in vitro se ve comprometida: la mayoría de las células mueren durante la primera semana de cultivo. Por lo tanto, es de gran importancia identificar formas de aumentar la durabilidad de las células neuronales en cultivo.
El carbonato de calcio en forma de aragonita cristalina derivada del esqueleto de los corales se puede utilizar como una matriz activa superior para cultivos neuronales. Al nutrir, proteger y activar las células gliales, el esqueleto de coral mejora la supervivencia y el crecimiento de estas células in vitro mejor que otras matrices.
Este protocolo describe un método para cultivar células del hipocampo en una matriz coralina. Esta matriz se genera uniendo granos de esqueletos de coral a platos de cultivo, frascos y cubreobjetos de vidrio. Los granos ayudan a mejorar el entorno de las células introduciéndolas en un entorno tridimensional fino (3D) para crecer y formar estructuras similares a tejidos. El entorno 3D introducido por el esqueleto de coral se puede optimizar para las células mediante molienda, lo que permite controlar el tamaño y la densidad de los granos (es decir, la rugosidad de la matriz), una propiedad que se ha encontrado que influye en la actividad de las células gliales. Además, el uso de granos facilita la observación y el análisis de los cultivos, especialmente cuando se utiliza microscopía óptica. Por lo tanto, el protocolo incluye procedimientos para la generación y optimización de la matriz coralina como una herramienta para mejorar el mantenimiento y la funcionalidad de las células neuronales in vitro.
Introduction
Los cultivos de células neurales disociadas, en este caso las células del hipocampo, son un modelo experimental valioso para estudiar el crecimiento y la función neuronal, proporcionando un alto aislamiento celular y accesibilidad 1,2,3. Este tipo de cultivo se utiliza con frecuencia en neurociencia, desarrollo de fármacos e ingeniería de tejidos debido a la gran cantidad de información que se puede recopilar, como tasas de crecimiento y viabilidad, neurotoxicidad, crecimiento y redes de neuritas, conectividad sináptica y plasticidad, modificaciones morfológicas, organización y cableado de neuritas, etc.1,4,5,6,7.
A pesar de la importancia de los cultivos, las células cultivadas generalmente se ven obligadas a crecer en cubreobjetos de vidrio en una monocapa bidimensional. Estas modificaciones ambientales estrictas disminuyen significativamente la capacidad de las células neurales para sobrevivir en el tiempo, ya que los cubreobjetos de vidrio son sustratos no nutritivos con una baja fuerza de adhesión, exhibiendo una menor capacidad para soportar el crecimiento celular 8,9,10,11.
Debido a que las células neuronales cultivadas se ven obligadas a crecer en condiciones difíciles, un enfoque esencial para mejorar su supervivencia sería imitar su entorno natural tanto como sea posible12,13. Esto podría lograrse mediante el uso de biomateriales que actuarán como matrices e imitarán la matriz extracelular de las células, permitiéndoles formar una estructura similar a un tejido y ayudar en su nutrición14.
El uso de biomateriales es un enfoque prometedor para mejorar los cultivos celulares, ya que actúan como andamios biocompatibles, proporcionando estabilidad mecánica y mejorando una variedad de propiedades celulares, incluyendo adhesión, supervivencia, proliferación, migración, morfogénesis y diferenciación15,16,17. Se utilizan varios tipos de biomateriales para mejorar las condiciones de las células in vitro. Entre ellos se encuentran los biopolímeros, o componentes biológicos que suelen formar parte de la matriz extracelular de las células. Estos biomateriales se utilizan principalmente como una forma de agentes de recubrimiento polimerizados o hidrogeles18,19,20. Por un lado, las matrices mencionadas anteriormente dan a las células un entorno 3D familiar para crecer, fomentan su adhesión al plato y les dan soporte mecánico21,22. Por otro lado, su forma polimerizada y el confinamiento de las células dentro de hidrogeles perturba el acceso de las células a los componentes nutritivos presentes en los medios de crecimiento y también dificulta el seguimiento de las células por métodos microscópicos23.
Los exoesqueletos de coral son matrices biológicas de origen marino. Están hechos de carbonato de calcio, tienen estabilidad mecánica y son biodegradables. Estudios previos que utilizan el esqueleto de coral como matriz para el crecimiento de células neuronales en cultivo han demostrado una adhesión mucho mayor, en comparación con los cubreobjetos de vidrio24,25. Además, las células neurales cultivadas en el esqueleto de coral demostraron su capacidad para ingerir el calcio del que está compuesto el esqueleto, que protege las células neurales en condiciones de privación de nutrientes26. Además, el esqueleto de coral es una matriz de apoyo y crianza que aumenta la supervivencia de las células neuronales, estimula la formación de redes neuronales, eleva la tasa de conectividad sináptica y permite la formación de estructuras similares a tejidos27,28. Estudios recientes también han demostrado que la topografía superficial de la matriz del esqueleto de coral juega un papel crucial en la distribución y activación de las células gliales 8,29. Además, el esqueleto de coral es eficaz como matriz para el cultivo de otros tipos de células, como osteocitos30,31, hepatocitos y cardiomiocitos en cultivo (datos no publicados).
Por lo tanto, el esqueleto de coral es una matriz prometedora para el cultivo de células in vitro. Por lo tanto, el protocolo detallado a continuación describe la técnica de cultivo de células neuronales en esqueleto de coral para producir cultivos neuronales más estables y prósperos que los logrados por los métodos existentes. Este protocolo también puede ser útil para el cultivo de cardiomiocitos, hepatocitos y otros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica presentada aquí describe una forma de mejorar el mantenimiento y la funcionalidad de las células neuronales en cultivo. Esto se logra adhiriendo las células a una matriz hecha de granos de esqueleto de coral que nutre las células y promueve su crecimiento y actividad. El uso de esta técnica aumenta la capacidad del modelo de cultivo neuronal para imitar el entorno de las células en el cerebro.
La introducción de la matriz como sustrato de cultivo tiene varias ventajas sobre …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el programa KAMIN del Ministerio de Comercio y Trabajo de Israel y por Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, Estados Unidos.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
Riferimenti
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
