Повышение долговечности диссоциированных культур нервных клеток с использованием биологически активного кораллового матрикса
Summary
Диссоциированная культура клеток гиппокампа является ключевым экспериментальным инструментом в нейробиологии. Выживание и функция нервных клеток в культуре улучшаются, когда коралловые скелеты используются в качестве матриц из-за их нейропротекторной и нейромодулирующей роли. Следовательно, нервные клетки, выращенные на коралловом матриксе, демонстрируют более высокую прочность и, следовательно, более пригодны для культивирования.
Abstract
Культуры диссоциированных нейрональных и глиальных клеток гиппокампа являются ценной экспериментальной моделью для изучения роста и функции нейронов, обеспечивая высокую изоляцию клеток и контролируемую среду. Однако выживание клеток гиппокампа in vitro находится под угрозой: большинство клеток умирают в течение первой недели культивирования. Поэтому большое значение имеет определение путей повышения долговечности нервных клеток в культуре.
Карбонат кальция в форме кристаллического арагонита, полученного из скелета кораллов, может быть использован в качестве превосходной, активной матрицы для нейронных культур. Питая, защищая и активируя глиальные клетки, коралловый скелет улучшает выживание и рост этих клеток in vitro лучше, чем другие матрицы.
Этот протокол описывает метод культивирования клеток гиппокампа на коралловой матрице. Эта матрица генерируется путем прикрепления зерен коралловых скелетов к культуральным чашкам, колбам и стеклянным покровным стеклам. Зерна помогают улучшить среду клеток, вводя их в тонкую трехмерную (3D) среду для роста и формирования тканеподобных структур. 3D-среда, введенная коралловым скелетом, может быть оптимизирована для клеток путем измельчения, что позволяет контролировать размер и плотность зерен (т.е. шероховатость матрицы), свойство, которое, как было установлено, влияет на активность глиальных клеток. Кроме того, использование зерен облегчает наблюдение и анализ культур, особенно при использовании световой микроскопии. Следовательно, протокол включает процедуры генерации и оптимизации коралловой матрицы в качестве инструмента для улучшения поддержания и функциональности нервных клеток in vitro.
Introduction
Культуры диссоциированных нервных клеток, в данном случае клеток гиппокампа, являются ценной экспериментальной моделью для изучения роста и функции нейронов, обеспечивая высокую изоляцию и доступность клеток 1,2,3. Этот тип культуры часто используется в неврологии, разработке лекарств и тканевой инженерии из-за большого количества информации, которая может быть собрана, такой как скорость роста и жизнеспособности, нейротоксичность, рост нейритов и создание сетей, синаптическая связь и пластичность, морфологические модификации, организация и проводка нейритов и т. д.1,4,5,6,7.
Несмотря на значимость культур, культивируемые клетки обычно вынуждены расти на стеклянных покровных стеклах в двумерном монослое. Эти строгие изменения окружающей среды значительно снижают способность нервных клеток выживать с течением времени, поскольку стеклянные покровные стекла являются непитательными субстратами с низкой адгезионной прочностью, демонстрирующими меньшую способность поддерживать рост клеток 8,9,10,11.
Поскольку культивируемые нервные клетки вынуждены расти в сложных условиях, важным подходом к повышению их выживаемости было бы максимально возможное имитирование их естественной средыобитания 12,13. Это может быть достигнуто с помощью биоматериалов, которые будут действовать как матрицы и имитировать внеклеточный матрикс клеток, позволяя им формировать тканеподобную структуру и помогать в их питании14.
Использование биоматериалов является перспективным подходом в улучшении клеточных культур, поскольку они действуют как биосовместимые каркасы, обеспечивая механическую стабильность и усиливая различные свойства клеток, включая адгезию, выживаемость, пролиферацию, миграцию, морфогенез и дифференцировку15,16,17. Для улучшения состояния клеток in vitro используется несколько видов биоматериалов. Среди них есть биополимеры, или биологические компоненты, которые обычно входят в состав внеклеточного матрикса клеток. Эти биоматериалы в основном используются в виде полимеризованных покрывающих агентов или гидрогелей18,19,20. С одной стороны, упомянутые выше матрицы дают клеткам знакомую 3D-среду для роста, стимулируют их адгезию к тарелке и дают им механическую поддержку21,22. С другой стороны, их полимеризованная форма и удержание клеток в гидрогелях нарушают доступ клеток к питательным компонентам, присутствующим в питательных средах, а также затрудняют наблюдение за клетками микроскопическими методами23.
Коралловые экзоскелеты представляют собой биологические матрицы морского происхождения. Они изготовлены из карбоната кальция, обладают механической стабильностью и являются биоразлагаемыми. Предыдущие исследования с использованием кораллового скелета в качестве матрицы для выращивания нервных клеток в культуре показали гораздо большую адгезию по сравнению со стеклянными покровными стеклами24,25. Кроме того, нервные клетки, выращенные на скелете коралла, продемонстрировали свою способность поглощать кальций, из которого состоит скелет, который защищает нервные клетки в условиях дефицита питательных веществ26. Кроме того, коралловый скелет является поддерживающей и питающей матрицей, которая увеличивает выживаемость нервных клеток, стимулирует образование нейронных сетей, повышает скорость синаптической связи и позволяет формировать тканеподобные структуры27,28. Недавние исследования также показали, что топография поверхности матрицы кораллового скелета играет решающую роль в распределении и активации глиальных клеток 8,29. Кроме того, коралловый скелет эффективен в качестве матрицы для культивирования других типов клеток, таких как остеоциты30,31, гепатоциты и кардиомиоциты в культуре (неопубликованные данные).
Таким образом, скелет коралла является перспективной матрицей для культивирования клеток in vitro. Таким образом, протокол, подробно описанный ниже, описывает технику культивирования нервных клеток на коралловом скелете для получения более стабильных и процветающих нейронных культур, чем те, которые достигаются существующими методами. Этот протокол также может быть полезен для культивирования кардиомиоцитов, гепатоцитов и других типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методика, представленная здесь, описывает способ улучшения поддержания и функциональности нервных клеток в культуре. Это достигается путем присоединения клеток к матрице из коралловых скелетных зерен, которая питает клетки и способствует их росту и активности. Использование этого ме…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась программой KAMIN Министерства торговли и труда Израиля и компанией Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, США.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
Riferimenti
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
