Øget holdbarhed af dissocierede neurale cellekulturer ved hjælp af biologisk aktiv korallinjematrix
Summary
Dissocieret hippocampus cellekultur er et centralt eksperimentelt værktøj i neurovidenskab. Neurale cellers overlevelse og funktion i kultur forbedres, når korallinjeskeletter bruges som matricer på grund af deres neurobeskyttende og neuromodulerende roller. Derfor viser neurale celler dyrket på korallinjematrix højere holdbarhed og er derved mere egnede til dyrkning.
Abstract
Kulturer af dissocierede hippocampale neuronale og gliaceller er en værdifuld eksperimentel model til at studere neural vækst og funktion ved at tilvejebringe høj celleisolering og et kontrolleret miljø. Imidlertid er overlevelsen af hippocampale celler in vitro kompromitteret: de fleste celler dør i løbet af den første uge af kulturen. Det er derfor af stor betydning at identificere måder at øge holdbarheden af neurale celler i kultur.
Calciumcarbonat i form af krystallinsk aragonit afledt af korallernes skelet kan anvendes som en overlegen, aktiv matrix til neurale kulturer. Ved at pleje, beskytte og aktivere gliaceller forbedrer koralskelettet overlevelsen og væksten af disse celler in vitro bedre end andre matricer.
Denne protokol beskriver en metode til dyrkning af hippocampale celler på en korallinjematrix. Denne matrix genereres ved at fastgøre korn af koralskeletter til kulturskåle, kolber og glasdæksler. Kornene hjælper med at forbedre cellernes miljø ved at introducere dem til et fint tredimensionelt (3D) miljø at vokse på og danne vævslignende strukturer. 3D-miljøet, der introduceres af koralskelettet, kan optimeres til cellerne ved slibning, hvilket muliggør kontrol over kornets størrelse og densitet (dvs. matrixruheden), en egenskab, der har vist sig at påvirke gliacellernes aktivitet. Desuden gør brugen af korn observation og analyse af kulturerne lettere, især når man bruger lysmikroskopi. Derfor inkluderer protokollen procedurer til generering og optimering af korallinjematrixen som et værktøj til at forbedre vedligeholdelsen og funktionaliteten af neurale celler in vitro.
Introduction
Kulturer af dissocierede neurale celler, i dette tilfælde hippocampale celler, er en værdifuld eksperimentel model til undersøgelse af neural vækst og funktion ved at tilvejebringe høj celleisolering og tilgængelighed 1,2,3. Denne type kultur bruges ofte inden for neurovidenskab, lægemiddeludvikling og vævsteknik på grund af den store mængde information, der kan indsamles, såsom vækstrater og levedygtighed, neurotoksicitet, neuritudvækst og netværk, synaptisk forbindelse og plasticitet, morfologiske modifikationer, neuritters organisation og ledninger osv.1,4,5,6,7.
På trods af kulturernes betydning er de dyrkede celler normalt tvunget til at vokse på glasdæksler i et todimensionelt monolag. Disse strenge miljøændringer reducerer neurale cellers evne til at overleve over tid betydeligt, fordi glasdæksler er ikke-plejende substrater med lav vedhæftningsstyrke, der udviser en lavere kapacitet til at understøtte cellevækst 8,9,10,11.
Fordi dyrkede neurale celler er tvunget til at vokse under udfordrende forhold, ville en vigtig tilgang til at forbedre deres overlevelse være at efterligne deres naturlige miljø så meget som muligt12,13. Dette kan opnås ved at bruge biomaterialer, der fungerer som matricer og efterligner cellernes ekstracellulære matrix, så de kan danne en vævslignende struktur og hjælpe med deres næring14.
Anvendelsen af biomaterialer er en lovende tilgang til forbedring af cellekulturer, fordi de fungerer som biokompatible stilladser, der giver mekanisk stabilitet og forbedrer en række celleegenskaber, herunder vedhæftning, overlevelse, spredning, migration, morfogenese og differentiering15,16,17. Flere typer biomaterialer bruges til at forbedre cellernes betingelser in vitro. Blandt dem er biopolymerer eller biologiske komponenter, der normalt er en del af cellernes ekstracellulære matrix. Disse biomaterialer anvendes mest som en form for polymeriserede belægningsmidler eller hydrogeler18,19,20. På den ene side giver matricerne nævnt ovenfor cellerne et velkendt 3D-miljø at vokse i, tilskynder deres vedhæftning til skålen og giver dem mekanisk støtte21,22. På den anden side forstyrrer deres polymeriserede form og indeslutning af cellerne i hydrogeler cellernes adgang til plejende komponenter, der er til stede i vækstmediet, og gør også opfølgningen af cellerne ved mikroskopiske metoder vanskeligere23.
Koraleksoskeletter er biologiske matricer med havoprindelse. De er lavet af calciumcarbonat, har mekanisk stabilitet og er biologisk nedbrydelige. Tidligere undersøgelser, der bruger koralskelettet som en matrix til dyrkning af neurale celler i kultur, har vist meget større vedhæftning sammenlignet med glasdæksler24,25. Derudover viste neurale celler dyrket på koralskelet deres evne til at indtage det calcium, skelettet består af, hvilket beskytter neurale celler under betingelser med næringsstofmangel26. Desuden er koralskelettet en støttende og nærende matrix, der øger overlevelsen af neurale celler, tilskynder til dannelse af neurale netværk, hæver hastigheden af synaptisk forbindelse og muliggør dannelse af vævslignende strukturer27,28. Nylige undersøgelser har også vist, at overfladetopografien af koralskeletmatrixen spiller en afgørende rolle i fordelingen og aktiveringen af gliaceller 8,29. Koralskelet er også effektivt som en matrix til dyrkning af andre celletyper, såsom osteocytter30,31, hepatocytter og kardiomyocytter i kultur (upublicerede data).
Derfor er koralskelet en lovende matrix til dyrkning af celler in vitro. Således beskriver protokollen beskrevet nedenfor teknikken til dyrkning af neurale celler på koralskelet til fremstilling af mere stabile og velstående neurale kulturer end dem, der opnås ved eksisterende metoder. Denne protokol kan også være nyttig til dyrkning af kardiomyocytter, hepatocytter og andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikken, der præsenteres her, beskriver en måde at forbedre vedligeholdelsen og funktionaliteten af neurale celler i kultur. Dette opnås ved at klæbe cellerne til en matrix lavet af koralskeletkorn, der nærer cellerne og fremmer deres vækst og aktivitet. Brug af denne teknik øger den neurale kulturmodels kapacitet til at efterligne cellernes miljø i hjernen.
Indførelsen af matrixen som et kultursubstrat har flere fordele i forhold til andre substrater, der anvendes i klassiske neura…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af KAMIN programmet fra det israelske handels- og arbejdsministerium og af Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, USA.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
Riferimenti
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
