Summary
Dissociert hippocampus cellekultur er et sentralt eksperimentelt verktøy i nevrovitenskap. Nevral celleoverlevelse og funksjon i kultur forbedres når korallskjeletter brukes som matriser, på grunn av deres nevrobeskyttende og nevromodulative roller. Derfor viser nevrale celler dyrket på korallmatriks høyere holdbarhet, og er dermed mer tilstrekkelige for dyrking.
Abstract
Kulturer av dissosierte hippocampus-, nevron- og gliaceller er en verdifull eksperimentell modell for å studere nevral vekst og funksjon ved å gi høy celleisolasjon og et kontrollert miljø. Imidlertid er overlevelsen av hippocampusceller in vitro kompromittert: de fleste celler dør i løpet av den første uken av kulturen. Det er derfor av stor betydning å identifisere måter å øke holdbarheten til nevrale celler i kultur.
Kalsiumkarbonat i form av krystallinsk aragonitt avledet fra skjelettet av koraller kan brukes som en overlegen, aktiv matrise for nevrale kulturer. Ved å pleie, beskytte og aktivere gliaceller forbedrer korallskjelettet overlevelsen og veksten av disse cellene in vitro bedre enn andre matriser.
Denne protokollen beskriver en metode for å dyrke hippocampusceller på en korallmatrise. Denne matrisen genereres ved å feste korn av korallskjeletter til kulturretter, kolber og glassdeksler. Kornene hjelper til med å forbedre miljøet i cellene ved å introdusere dem til et fint tredimensjonalt (3D) miljø for å vokse på og danne vevlignende strukturer. 3D-miljøet introdusert av korallskjelettet kan optimaliseres for cellene ved sliping, noe som muliggjør kontroll over kornets størrelse og tetthet (dvs. matriksruheten), en egenskap som har vist seg å påvirke glialcelleaktiviteten. Videre gjør bruken av korn observasjon og analyse av kulturen enklere, spesielt ved bruk av lysmikroskopi. Derfor inneholder protokollen prosedyrer for generering og optimalisering av korallinmatrisen som et verktøy for å forbedre vedlikehold og funksjonalitet av nevrale celler in vitro.
Introduction
Kulturer av dissosierte nevrale celler, i dette tilfellet hippocampusceller, er en verdifull eksperimentell modell for å studere nevral vekst og funksjon ved å gi høy celleisolasjon og tilgjengelighet 1,2,3. Denne typen kultur brukes ofte i nevrovitenskap, stoffutvikling og vevsteknikk på grunn av den store mengden informasjon som kan samles inn, for eksempel veksthastighet og levedyktighet, nevrotoksisitet, nevrittutvekst og nettverk, synaptisk tilkobling og plastisitet, morfologiske modifikasjoner, nevrittorganisasjon og ledninger, etc.1,4,5,6,7.
Til tross for kulturens betydning, blir de kultiverte cellene vanligvis tvunget til å vokse på glassdeksel i et todimensjonalt monolag. Disse strenge miljømodifikasjonene reduserer signifikant nevrale cellers evne til å overleve over tid, fordi glassdeksler er ikke-nærende substrater med lav vedheftstyrke, og viser en lavere kapasitet til å støtte cellevekst 8,9,10,11.
Fordi dyrkede nevrale celler blir tvunget til å vokse under utfordrende forhold, vil en viktig tilnærming for å forbedre overlevelsen være å etterligne sitt naturlige miljø så mye som mulig12,13. Dette kan oppnås ved å bruke biomaterialer som vil fungere som matriser og etterligne den ekstracellulære matrisen til cellene, slik at de kan danne en vevlignende struktur og bistå i næring14.
Bruken av biomaterialer er en lovende tilnærming til å forbedre cellekulturer, fordi de fungerer som biokompatible stillas, gir mekanisk stabilitet og forbedrer en rekke celleegenskaper, inkludert vedheft, overlevelse, spredning, migrasjon, morfogenese og differensiering15,16,17. Flere typer biomaterialer brukes til å forbedre forholdene til cellene in vitro. Blant dem er biopolymerer, eller biologiske komponenter som vanligvis er en del av den ekstracellulære matrisen av cellene. Disse biomaterialene brukes mest som en form for polymeriserte beleggmidler eller hydrogeler18,19,20. På den ene siden gir matrisene nevnt ovenfor cellene et kjent 3D-miljø å vokse i, oppmuntre deres vedheft til parabolen og gi dem mekanisk støtte21,22. På den annen side forstyrrer deres polymeriserte form og innesperring av cellene i hydrogeler cellens tilgang til pleiende komponenter som er tilstede i vekstmediet, og gjør også oppfølgingen av cellene ved mikroskopiske metoder vanskeligere23.
Koralleksoskjeletter er biologiske marine-opprinnelsesmatriser. De er laget av kalsiumkarbonat, har mekanisk stabilitet og er biologisk nedbrytbare. Tidligere studier som bruker korallskjelettet som matrise for dyrking av nevrale celler i kultur har vist mye større vedheft, sammenlignet med glassdeksler24,25. I tillegg demonstrerte nevrale celler dyrket på korallskjelett sin evne til å innta kalsiumet skjelettet består av, som beskytter nevrale celler under forhold med næringsmangel26. Videre er korallskjelettet en støttende og nærende matrise som øker overlevelsen av nevrale celler, oppfordrer dannelsen av nevrale nettverk, øker graden av synaptisk tilkobling og muliggjør dannelsen av vevlignende strukturer27,28. Nylige studier har også vist at overflatetopografien til korallskjelettmatrisen spiller en avgjørende rolle i distribusjonen og aktiveringen av gliaceller 8,29. Korallskjelett er også effektivt som matrise for dyrking av andre celletyper, for eksempel osteocytter30,31, hepatocytter og kardiomyocytter i kultur (upubliserte data).
Derfor er korallskjelett en lovende matrise for dyrking av celler in vitro. Dermed beskriver protokollen beskrevet nedenfor teknikken for å dyrke nevrale celler på korallskjelett for å produsere mer stabile og velstående nevrale kulturer enn de som oppnås ved eksisterende metoder. Denne protokollen kan også være nyttig for dyrking av kardiomyocytter, hepatocytter og andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av dyr i denne protokollen ble godkjent av National Animal Care and Use Committee.
MERK: Kalsiumkarbonerte korallskjeletter bør brukes i krystallinsk form av aragonitt. Koralltypene som hittil er testet for nevrale kulturer er Porites Lutea, Stylophora Pistillata og Trachyphyllia Geoffroyi. Skjelettene kan kjøpes hele eller malt.
1. Rengjøring av korallskjelettbitene
FORSIKTIG: Følgende trinn skal utføres i en kjemisk hette ved romtemperatur, fordi løsningene beskrevet nedenfor er farlige og kan forårsake brannskader og irritasjoner.
- Bruk en hammer til å bryte korallskjelettet og del det i 0,5-2 cm fragmenter. For å oppløse organiske og ikke-organiske rester, suge korallskjelettfragmentene i 10% natriumhypoklorittoppløsning i 10 minutter, vask deretter en gang med dobbeltdestillert vann (DDW).
- For å fjerne de gjenværende organiske restene, suge fragmentene i en 1M NaOH-løsning i 5 minutter, vask deretter en gang med DDW. Fortsett med fjerning av organiske forekomster ved å suge fragmentene i 30%H2O2-løsningi 10 minutter, vask deretter fragmentene 3x med DDW.
- Fjern så mye overflødig DDW som mulig og la korallfragmentene i hetten tørke (1–8 timer).
2. Rengjøring av glassdekslene
- Overfør glassdekslene til en petriskål i 100 mm glass. Tilsett 10 ml 95% etanol i 15 min.
- Fjern etanolen og vask med DDW 3x, vent 10 min mellom hver vask. Legg fatet på en 80 °C forvarmet varmeplate til DDW fordamper. Rør forsiktig dekslene i platen flere ganger mens du tørker for å forhindre at de fester seg til hverandre.
- Autoklav dekslene.
3. Fremstilling av korallskjelettkorn
- Mal korallskjelettfragmentene med en mørtel og støt (manuell sliping) til fullstendig sammenbrudd. Resultatet er en blanding av korn med størrelser fra 20 μm-200 μm.
- Alternativt kan du male korallskjelettfragmentene ved hjelp av en elektrisk slipemaskin med en hastighet på 1000 o / min i 30 s (bladlengde = 6 cm; bredde = 0,5 cm - 1,0 cm). Den resulterende kornstørrelsen ligner størrelsesområdet produsert ved manuell sliping.
4. Rensing av korn av et bestemt størrelsesområde
MERK: Hvis kontroll over størrelsen på kornene i en matrise er ønsket, bruk følgende filtreringsbaserte kornrensingsprosedyre.
- Overfør kornene til en manuell eller elektrisk 40 μm filternettsil.
- Del kornene i to spesifikke områder ved å sile kornene gjennom silen (hvis du bruker en elektrisk sil, anbefales følgende forhold: risting = 600 amplituder / min, sprett = 6 / s). Denne prosedyren produserer to grupper kornstørrelser, en <40 μm og den andre >40 μm.
MERK: De to størrelsene kan bestemmes ved å bruke siler av varierende masker. Hvis du ønsker et mer begrenset område, sikter du hver gruppe på nytt fra trinn 4.2 gjennom siler med forskjellige masker. - Autoklav kornene.
5. Tilberedning av korallkornbelagte retter eller dekksedler
- For å belegge kolber, tallerkener eller petriskåler
MERK: Følgende trinn bør utføres under sterile forhold.- Tilsett korallskjelettkornene i en 20 μg / ml poly-D-lysin (PDL) løsning oppløst i Hanks 'løsning. Den anbefalte konsentrasjonen er 5 mg/10 mg korn per 1 ml PDL-oppløsning.
- Hell oppløsningen i kolber og fat (ca. 2 ml/25 cm2) og rug over natten ved 4 °C. Kornene synker og fester seg til bunnen.
- Neste dag, vask kolber og oppvasken en gang med steril DDW. La kolber og oppvask tørke i hetten.
NOTAT: Det er å foretrekke å bruke nybelagte kolber og retter. De belagte kolbene og tallerkenene kan brukes opptil en uke etter belegg hvis de konserveres ved 4 °C. Imidlertid kan effektiviteten av matrisen bli kompromittert.
- Belegning av glassdeksler (12 mm diameter, 0,17 mm tykkelse)
- Legg korallskjelettkorn til DDW ved ønsket konsentrasjon. De vanlige tetthetene som brukes til nevrale celler er 5 mg / ml og 10 mg / ml. Hell 40 μL av kornoppløsningen på midten av dekselet (figur 4).
- Plasser dekksedlene på en varmeplate forvarmet til 80 °C og vent på fullstendig fordampning (vanligvis 15 min). Under disse forholdene holder kornene seg til dekselet. Autoklav de belagte dekslene. Oppbevares under sterile forhold.
- En dag før kultur, plasser dekselene på lokket på en steril 24-brønnplate. Tilsett 100 μL 20 μg/ml PDL-oppløsning til hver dekkslipp. Bruk spissen for å sikre at væsken dekker hele kornområdet og resten av dekkflaten.
- Dekk lokket med bunnen av platen. Pakk sidene av platene med parafinfilm. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Neste dag, vask en gang med DDW og tørk i hetten.
MERK: Det er å foretrekke å bruke nybelagte deksler.
6. Dyrking av hippocampus dissosierte celler på korallskjelett kornbelagt glass coverslips
MERK: Metoden for hippocampus dissosiert cellekultur ble modifisert fra tidligere publiserte prosedyrer24,27. Forberedelsen av kulturen er beskrevet for fire rottepupper. Det forventede utbyttet fra hver hippocampus er 1–1,5 x 106 celler.
- Installasjonsprogrammet
- Forbered en tom 60 mm petriskål. Hell 2 ml minimalt essensielt medium (MEM) i en 60 mm petriskål og legg på is.
- Hell 2 ml MEM i en 35 mm tallerken og legg den i en inkubator ved 37 °C, 5–10 % CO2. Hell 2 ml MEM i et 15 ml rør og oppbevar det ved 4 °C.
- Hell 1 ml First Day Medium i et 15 ml rør og legg det i en inkubator ved 37 ° C, 5-10% CO2.
MERK: Sammensetningen av førstedagsmediet er beskrevet i materialfortegnelsen. - Tine 200 μL av en 2,5 % trypsinoppløsning og inkuber ved 37 °C.
- Forbered tre glass Pasteur pipetter med 0,5 mm, 0,75 mm og 1,0 mm diameter hoder ved hjelp av en flamme.
- Forbered tilstrekkelige kirurgiske verktøy: en stor saks, to små saks, en stor pinsett, fire små pinsetter og en skalpell.
- Forbered et stereomikroskop i hetten.
- Bruk en stor saks til å ofre 0–3 dager gamle Sprague Dawley-rotteunger ved å skille hodet fra kroppen i en tom 60 mm petriskål (trinn 6.1.1). Kast kroppene.
- Ta opp hodet ved å holde det fra munnen med en stor pinsett. Klipp huden som dekker skallen med en liten saks.
- Med en ren saks, gå inn under skallen (på siden av lillehjernen) og kutt skallen til høyre og til venstre for å muliggjøre fjerning. Bruk en liten pinsett, skrell skallen av fra hjernen.
- Med en ren pinsett skiller du hjernen fra hodet og legger den i en 60 mm petriskål som inneholder 2 ml kald MEM (se trinn 6.1.2).
- Bruk to små pinsett, dissekere hippocampi under et stereomikroskop. Overfør hippocampi til den tilberedte 35 mm tallerkenen (fra trinn 6.1.2) som inneholder MEM.
MERK: Trinn 6.3–6.6 bør gjentas for hver valp. - Skjær hippocampi til ca. 1 mm skiver ved hjelp av skalpellen. Tilsett 200 μL av trypsinoppløsningen (fortynnet til en endelig konsentrasjon på 0,25%). Bland forsiktig og rug ved 37 °C, 5–10 % CO2 i 30 minutter.
- Etter inkubering, tilsett 2 ml kald MEM (trinn 6.1.2) til parabolen for å deaktivere trypsinen. Overfør det trypsiniserte vevet til et 15 ml rør inneholdende 1 ml Første dag medium forvarmet til 37 °C (trinn 6.1.3) ved bruk av glasspipetten med størst diameter (trinn 6.1.5).
MERK: Det beste forholdet mellom medium og vev (v: v) for videre behandling av vevet er 1 ml / 8 hippocampi. Unngå å overføre mediet med vevet så mye som mulig. - Triturere vevet ved å føre det gjennom glasspipetten med største diameter 10-15 ganger. Gjenta deretter denne prosessen ved å bruke glasspipetten med middels diameter. Fortsett å triturere med pipetten med minste diameter. Unngå bobler for å redusere celledød.
- La de resterende vevstykkene synke i 2–5 minutter, og overfør deretter supernatanten til et annet 15 ml rør. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer.
MERK: Den foretrukne celletettheten er 200 000–400 000 celler/ml. Bruk første dag medium til å fortynne eller sentrifugere ved 470 x g for å konsentrere cellene. - Frø 100 μL celler på hvert glassdeksel. Mens du sådde, sørg for å dekke hele dekselet med celler. Inkuber ved 37 °C, 5–10 % CO2.
- Neste dag, tilsett 500 μL Neuronal Growth Medium til brønnene.
MERK: Sammensetningen av Neuronal Growth Medium er beskrevet i materialfortegnelsen. - Overfør forsiktig hver dekkslip til riktig brønn ved hjelp av en pinsett mens du fjerner First Day Medium ved å vippe dekselet. Sug det resterende mediet fra lokket.
- Inkuber ved 37 °C, 5–10 % CO2. Unngå å erstatte mediet gjennom inkubasjon. Kulturer kan opprettholdes under disse forholdene opptil 1 måned. Den største bekymringen er fuktighet. Sørg derfor for å opprettholde inkubatoren maksimalt fuktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å forberede korallskjelettmatrisen ble hele korallskjelettet (figur 1A) brutt i 0,5-2 cm fragmenter ved hjelp av en hammer (figur 1B) og grundig rengjort fra organiske rester gjennom tre trinn (trinn 1 i protokollen) ved bruk av 10% hypoklorittløsning, 1M NaOH-løsning og 30%H2O2-løsning(figur 1C). Korallfragmentene ble godt rengjort da skjelettfargen endret seg fra brun (figur 1D) til hvit (figur 1E). Deretter ble de rensede delene (figur 2A) malt ved hjelp av enten en mørtel og støt (figur 2B) eller en elektrisk slipemaskin (figur 2C). Begge prosedyrene ga lignende resultater: en blanding av korn som varierte mellom 20 μm og 200 μm i størrelse (figur 2D-G).
En av fordelene med kornet matrise over løselige substrater er at flere av dens strukturelle og fysiske egenskaper kan endres, noe som gjør den mer kvantitativ. I denne korallskjelettkornmatrisen ble to av kornblandingsegenskapene manipulert: kornstørrelse og korntetthet. For å redusere mangfoldet av 20 μm–200 μm størrelse generert av ovennevnte slipeprosedyre, ble det valgt en siktemetode ved hjelp av et filternett på 40 μm. Ved hjelp av manuelle (figur 3 A-D) eller elektriske (figur 3E) siler ble det produsert to typer kornblandinger: en med korn fra 40 μm-200 μm i størrelse (figur 3 F,H) og den andre med størrelse på 40 μm eller mindre (figur 3G,I). Tettheten av kornene som dekket dekkslipene og tallerkenene ble bestemt ganske enkelt ved å påføre varierende mengder korn og feste dem til dekkene ved varme (figur 4C) eller til kolber og retter etter tyngdekraften (figur 4H). På denne måten ble matriser med lav (figur 4 D,F,I) og høy tetthet (figur 4E,G,J) produsert.
Figur 5 viser utfallet av dyrking av hippocampusceller på dekklapper belagt med <40 μm (10 mg/ml) korallskjelettkorn. Fasekontrastmikrografer viser at cellene dannet komplekse nevrale nettverk i fravær (figur 5A) og tilstedeværelse (figur 5B) av matrisen. Cellekjernefarging (figur 5C,D) indikerte at 14 dager etter såing var celletettheten høyere på matriksen enn på de ubelagte dekslene. Farging med mikrotubuliassosiert protein 2 (MAP2) viste at et komplekst nevronalt og dendrittisk nettverk dannet seg på matrisen (figur 5F) sammenlignet med kontrollen (figur 5E). I tillegg gjennomgikk gliaceller dyrket på korallskjelettmatrisen visualisert ved hjelp av glial fibrillary acidic protein (GFAP) signifikante morfologiske endringer. De fikk et piggere utseende med lengre prosesser enn gliacellene som ble dyrket på kontrollsubstratet, hvor de virket rundere og flatere (figur 5G,H).
Figur 1: Rengjøring av korallskjelettet. (A) Skjelettet av korallen Stylophora pistillata. (B) Brutt ned fragmenter av skjelettet før rengjøring. (C) Fragmentene fra (B) etter behandling med hypoklorittløsning, natriumhydroksid og hydrogenperoksid. (D) Utvidelse av urenset fragment vist i (B). (E) Utvidelse av renset fragment vist i (C). Skala: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sliping av korallskjelettet. (A) Rensede korallskjelettfragmenter. (B) Mørtel og støt brukt til manuell sliping. Rød pil peker på de resulterende kornene. (C) Slipemaskin. Rød pil peker på de resulterende kornene. (D) Korn etter manuell sliping. (E) Korn etter mekanisk sliping. (f) Utvidelse av (d). (g) Utvidelse av (E). Skala: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kontroll over kornstørrelsen. (AD) Manuell anstrengelsesprosedyre. (A) Bruk av 40 μm sil. (B) Sil med uanstrengte jordkorn plassert i et 50 ml rør og anstrengt ved hjelp av en virvel. (C) Anstrengt <40 μm korn i bunnen av 50 ml røret. (D) Korn med en minimal størrelse som ligner på nettet (>40 μm, gul pil). (E) Mekanisk sil som brukes til å spenne <40 μm korn fra en blanding av korn 20 μm-200 μm i størrelse. (F) Demonstrasjon av forskjellige kornstørrelser etter sliping før siling. (G) Påvisning av anstrengte korn <40 μm. (H) Utvidelse av (F). (i) Utvidelse av (G). Skala: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kontrollere tettheten til matrisen. (A) Et 1,5 ml sentrifugerør med <40 μm korn fortynnet til 10 mg/ml med DDW for coverslips, PDL for andre retter. (B) Glassdeksel med 40 mikrol 10 mg/ml oppløsning. (C) Dekkslipp med 40 μL 10 mg/ml oppløsning som tørker på en kokeplate forvarmet til 80 °C, slik at kornene kan feste seg til dekselet. (D) Belagt dekkseddel med en kornkonsentrasjon på 5 mg/ml etter DDW-fordampning. (E) Belagt dekkseddel med en kornkonsentrasjon på 10 mg/ml etter DDW-fordampning. (f) Utvidelse av (d). (g) Utvidelse av (E). (H) En 10 mg/ml oppløsning i en T-25 kolbe, 60 mm plate. (I) Belagt kolbe med korn i en konsentrasjon på 5 mg / ml. (J) Belagt kolbe med korn i en konsentrasjon på 10 mg / ml. Skala: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Dyrking av hippocampusnevrale celler på korallskjelettmatrisen. Bilder viser celler hentet fra 0–3 dager gammel rottevalp hippocampi dyrket i kultur i 14 dager og farget med GFAP (røde, gliaceller), MAP2 (grønne, nevrale somas og dendritter), DAPI (blå, cellekjerner). (A) Fasekontrastbilde av celler i fravær av matrisen. (B) Fasekontrastbilde av celler dyrket på korallskjelettmatrisen. (C) Celler dyrket uten matrise farget med DAPI. (D) Celler dyrket på korallskjelettmatrisen farget med DAPI. (E) Celler dyrket i fravær av matrisen farget for MAP2. (F) Celler dyrket på korallskjelettmatrisen farget for MAP2. (G) Celler dyrket uten matriks farget for GFAP. (H) Celler dyrket på korallskjelettmatrisen farget for GFAP. (I) Sammenslått bilde av (C),(E),(G). (J) Sammenslått bilde av (D),(F),(H). Skala = 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken som presenteres her beskriver en måte å forbedre vedlikehold og funksjonalitet av nevrale celler i kultur. Dette oppnås ved å feste cellene til en matrise laget av korallskjelettkorn som nærer cellene og fremmer deres vekst og aktivitet. Ved hjelp av denne teknikken øker kapasiteten til nevralkulturmodellen for å etterligne cellenes miljø i hjernen.
Innføringen av matrisen som et kultursubstrat har flere fordeler i forhold til andre substrater som brukes i klassiske nevrale cellekulturmetoder. For det første øker det celleadherens. Kombinasjonen av korallskjelett og PDL gir et sterkere klebemiddel enn glass og PDL (ikke vist). En slik økning i klebende har vist seg å være avgjørende for overlevelsen av adherente ikke-flytende celler i kultur32. For det andre er kalsiumkarbonerte krystaller av korallskjelettkornene en kilde til kalsiumioner som faktisk absorberes av cellene. Det er høyst sannsynlig at dette er årsaken til økt holdbarhet og økt tetthet (figur 5C,D) av nevrale celler utstilt på korallskjelettmatrisen, sammenlignet med deres overlevelsesnivå i fravær26.
En tredje fordel ligger i det faktum at korallskjelettmatrisen faktisk er ikke-plan, i motsetning til glassdekselet. Kornene er 3D-strukturert med en kompleks, buet overflatearkitektur. Disse strukturelle egenskapene varierer når man vurderer at cellene står overfor kornpopulasjoner av varierende morfologier, dimensjoner og tettheter. Et slikt grovt og ikke-plant kulturstoff etterligner bedre miljøet til cellene in vivo enn det klassiske flate dekselet. Faktisk har vi vist at grovheten, størrelsen og morfologien til korallskjelettet påvirker cellefordeling, overlevelse og aktivitet 8,26,29.
Videre er 3D-konfigurasjonen som en korallskjelettmatrise gir cellene som et mikromiljø, vesentlig forskjellig fra de konvensjonelle hydrogelmatrisene som brukes til 3D-vekst in vitro. Ved bruk av hydrogeler, som kollagen og hyaluronsyre, er cellene innebygd i gelen23. Gelen ligner den ekstracellulære matrisen når det gjelder romfylling, stivhet og andre egenskaper, men på grunn av gelens viskositet krever disse kulturene kompliserte fôringssystemer for å holde cellene godt næret21,22. Derimot gjør korallskjelettets 3D-korn det mulig for cellene å okkupere overflaten, som er helt åpen for kulturmediet. Videre, i motsetning til hydrogelkulturene, overvåkes cellene på korallskjelettmatrisen lett gjennom fase- og fluorescerende mikroskopi.
Denne teknikken har flere begrensninger. Til tross for fordelene nevnt ovenfor, er korallskjelett et biomateriale og kan ikke fremstilles, men samles fra døde koraller, noe som forårsaker begrensninger i matriksforsyningen, selv om noen er tilgjengelige kommersielt. Bruk av skjeletter av flere korallarter kan også introdusere variasjoner i kulturegenskaper. På den annen side, det faktum at korallskjelettkrystaller alle er laget av ett stoff, aragonitt, og at størrelsen på kornene kan kontrolleres, eliminerer det meste av det kjemiske og strukturelle mangfoldet blant matrisene. Kornene til alle biomaterialene som testes er store nok til å tvinge cellene til å vokse tredimensjonalt. Cellene klatrer på kornene8, vokser ved å feste seg til spissene av krystallene33 og krysser mellom korn27. Alternativt er geologisk aragonitt, laget av fossile sedimenter og syntetisk kalsiumkarbonat, kommersielt tilgjengelig og kan brukes som matrise. Det kan imidlertid vise lavere vedheft til glassdekslene.
I lys av bruk av flere korallarter er det viktig å merke seg at noen studier har vist tegn på biomineralisering av koraller, noe som kan føre til tilstedeværelse av forskjellige organiske forekomster blant kalsiumkarbonatkrystallene. Disse kan ikke fjernes ved hjelp av rengjøringsprosessen beskrevet i denne protokollen 33,34. Dette faktum er av avgjørende betydning når man identifiserer et biomateriale for biologiske anvendelser. I denne studien ble det tidligere utført flere trinn for å sikre så mye homogenitet i stillaset som mulig. Først ble tre typer koraller testet for matriser: Porites Lutea, Stylophora Pistillata og Trachyphyllia Geoffroyi. Det var ingen signifikante endringer når det gjelder vekst og overlevelse av nevrale celler på disse korallskjelettene. Dette resultatet kan tyde på at ulike organiske avsetninger i skjelettet ikke har vesentlig innflytelse i dette tilfellet. For det andre viste Fourier-transform infrarød spektroskopi av rent korallskjelett fravær av organiske rester29.
Det er noen kritiske skritt i protokollen som bør tas i betraktning. For det første, mens du sikter kornene manuelt, anbefales det å bytte sil fra tid til annen, da silene har en tendens til å tette seg. Den elektriske silen bruker større kraft under sikting. Dermed har den ikke en tendens til å tette seg like lett. For det andre, mens du sprer PDL-korallkornblandingen på oppvasken og dekkslippene, er det viktig å pipette blandingen ofte for å unngå at kornene synker. Det vil sikre en homogen spredning av løsningen. Det er viktig å være oppmerksom på festeprosessen av kornene til dekslene. Feil oppvarmingstemperaturer under kornfesting til glassdekselet, vibrasjoner og andre faktorer kan føre til at kornene løsner før eller etter cellesåing. Det anbefales å løse dette problemet ved å nøye kontrollere temperaturen og minimere vibrasjoner. Videre er det å foretrekke å utføre forsøkene på et bestemt tidspunkt etter å ha belagt kolber og servise. Vi anbefaler å ferske oppvasken en dag før kultur. Langvarig inkubasjon av retter med PDL-kornblandingen kan resultere i mangfold i mengden av de vedlagte kornene til parabolen.
Noen modifikasjoner av teknikken beskrevet ovenfor er mulige i henhold til behovene til de dyrkede cellene. I tillegg til sin evne til å forbedre veksten av nevrale celler i kultur, støtter korallskjelettmatriser vekst av osteocytter30,31, hepatocytter og kardiomyocytter (upubliserte data). For å øke kulturens holdbarhet av andre celletyper, anbefales det å sjekke om den sterkeste cellereaksjonen på skjeletter av forskjellige koralltyper, samt optimalisere kornets størrelse og tetthet.
Det er også mulig å dyrke nevrale celler direkte på kornene, uten ytterligere belegg. Imidlertid forbedrer forbelegget av kornene med PDL, som nevnt i denne protokollen (trinn 5), adhesjonen og overlevelsen av nevrale celler, over nivåene oppnådd med PDL-belagt glass. Det er også mulig å bruke andre belegningsmaterialer i henhold til preferansen til forskjellige celletyper.
Det er verdt å nevne at størrelsen på kornene i matrisen er begrenset. Over en viss terskel, ca. 200 μm, blir det vanskelig å binde dem til glassdekslene. Derfor har ruheten på matriseoverflaten et endelig område. Eksperimenter som krever større korn eller skjelettbiter er ikke egnet for denne teknikken. Man kan finne en alternativ måte å feste større korn på, kanskje ved hjelp av lim eller geler, men dette kan skjule cellekontakten med kornene. En annen mulighet er å dyrke cellene direkte på skjelettet, uten sliping. Denne metoden krever en modifikasjon av cellesåingsprosedyren24,27. 3D-strukturen til det ikke-malte korallskjelettet bidrar til nevral celleoverlevelse, som vi rapporterte før26. En slik kompleks og tett matrise gjør imidlertid mikroskopiarbeid vanskelig. Det kompromitterte oppsettet av jordskjelettet bevarer skjelettets kjemiske egenskaper, muliggjør 2D-mikroskopianalyse, og på grunn av kornets store størrelse tvinger cellene til å vokse i 3D8.
Videre kan et overskudd av korallskjelettkorn være giftig. Som nevnt ovenfor absorberes kalsiumkomponenten i korallskjelettmatrisen av cellene35. Kalsiumoverskudd forårsaket av høy korntetthet kan være en byrde eller til og med hemmende for noen celletyper, som i tilfelle av nevrale celler36. Derfor kan en reduksjon av korntetthet være nødvendig og optimalisert for hver celletype. I tillegg er det viktig å huske at tilgjengeligheten av korallskjeletter kan være begrenset. Koraller vokser sakte i akvarier og i sitt naturlige miljø. Veksten hemmes ytterligere som følge av global oppvarming og havforsuring37. Dermed er overflod og tilgjengelighet av korallskjeletter begrenset.
Styrking av dissosierte nevrale celler når de kommer i kontakt med korallskjelettkorn i kultur åpner nye veier for forskning innen nevrobiologi. Cellulær vekst, neurittisk forlengelse og forgrening, samt synaptogenese og synaptisk plastisitet, kan studeres med forbedret intensitet og langvarig eksperimentell varighet.
Det ser også ut til at korallinmatrisen forårsaker en økning i noen av glialcellenes cellulære funksjoner, som vekst, reaktivitet og spredning. Det er derfor mulig at disse forholdene også øker astrocyttkapasiteten til å berike det dissosierte nevrale kulturmediet med utskilte trofiske faktorer, noe som kan være anvendelig for regenerativ medisin i sentralnervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Kamin-programmet til det israelske handels- og arbeidsdepartementet og av Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R.
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
