Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segnalazione di notch regola il mantenimento delle cellule staminali/progenitrici neurali mediante interazioni cellula-cellula. I componenti della segnalazione Notch presentano un'espressione dinamica. L'efere di segnalazione della nota Hes1 e il Delta-simile a 1 (Dll1) del ligando di Notch sono espressi in modo oscillatorio nelle cellule staminali/progenitrici neurali. Poiché il periodo dell'espressione oscillatoria di questi geni è molto breve (2 h), è difficile monitorarne l'espressione ciclica. Per esaminare tali rapidi cambiamenti nell'espressione genica o nella dinamica delle proteine, sono necessari giornalisti a risposta rapida. A causa della sua cinetica a maturazione rapida e dell'elevata sensibilità, il reporter di bioluminescenza luciferasi è adatto per monitorare i rapidi cambiamenti dell'espressione genica nelle cellule viventi. Abbiamo usato un giornalista di luciferasi destabilizzato per monitorare l'attività promotore e un reporter con luciferasi fuso per la visualizzazione delle dinamiche proteiche a risoluzione cellulare singola. Questi reporter di bioluminescenza mostrano un rapido turnover e generano segnali molto deboli; pertanto, abbiamo sviluppato un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile per rilevare tali deboli segnali. Questi metodi ci permettono di monitorare varie dinamiche di espressione genica nelle cellule viventi e nei tessuti, che sono informazioni importanti per aiutare a comprendere gli stati cellulari effettivi.
Introduzione
Il cervello dei mammiferi è composto da un gran numero di vari tipi di neuroni e cellule gliali. Tutte le cellule sono generate da cellule staminali neurali,progenitrici (NPC), che prima proliferano per espandere il loro numero, poi iniziano a differenziarsi in neuroni, e infine danno origine a cellule gliali1,2,3,4,5. Una volta che le cellule si sono differenziate in neuroni, non possono proliferare o aumentare il loro numero e, quindi, il mantenimento dei PNG fino a quando le fasi successive non sono impo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali istituzionali presso l'Istituto per la vita di frontiera e le scienze mediche dell'Università di Kyoto.
1. Giornalisti di bioluminescenza
NOTA: Il reporter luciferate è adatto per misurare la rapida dinamica dell'attività promotrice fondendo il segnale di degradazione. Inoltre, il reporter di fusione luciferasi consente il monitoraggio delle dinamiche proteiche nella singola cellula. Entrambi i tipi di reporter sono disponibili per l'esperimento di coltura monostrato (cultura della dissociazione) e d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Le espressioni dei geni Hes1/7 presentano un ciclo di oscillazione di 2 h in varie linee cellulari e durante la somitogenesi. Inoltre, il periodo di oscillazione è molto breve e sia i loro mRNA che le proteine sono estremamente instabili con le emivite di circa 20 min. Se si utilizza un reporter a risposta lenta, non possiamo tracciare una dinamica così rapida, e se si usa un reporter stabile, si accumula gradualmente mentre l'espressione genica oscilla. Pertanto, il giornalista deve essere rapidamente degradato.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I componenti della segnalazione di Notch mostrano espressioni oscillatorie in sincronia durante la somitogenesi ma fuori sincronia durante la neurogenesi, portando alle difficoltà nel catturare la dinamica dell'espressione mediante analisi statica in quest'ultimo caso. Pertanto, il monitoraggio in tempo reale è necessario per rivelare la dinamica di espressione dei componenti di segnalazione Notch, ad esempio Hes1 e Dll1. Poiché i periodi delle espressioni delle oscillazioni Hes1 e Dll1
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari contrastanti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Yumiko Iwamoto per aver sostenuto la produzione del video. Siamo anche grati ad Akihiro Isomura per la discussione e il supporto dell'analisi delle immagini, Hitoshi Miyachi per il supporto tecnico per la generazione di animali transgenici, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) per il supporto tecnico e le discussioni del sistema di imaging di bioluminescenza. Questo lavoro è stato supportato da Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Circolatore d'acqua refrigerata (chiller) | Julabo | Modello: F12-ED | |
| Telecamera CCD raffreddata | Andor Technology | Modello: iKon-M 934 | |
| Sistema di incubazione | TOKAI HIT | Modello: INU-ONICS | |
| Microscopio invertito | Olympus | Modello: IX81 | |
| Microscopio invertito | Olympus | Modello: IX83 | |
| Dispositivo di illuminazione a LED | CoolLED | Modello: pE1 | |
| MetaMorph | DISPOSITIVI MOLECOLARI | Modello: 40000 | |
| Regolatore di gas | Tokken | Modello: TK-MIGM OLO2 | |
| Obiettivo | Olympus | Modello: UPLFLN 40X O | |
| Preparazioni per la dissezione | |||
| Microscopio per dissezione | Nikon | Modello: SMZ-2B | |
| Microscopio stereoscopico a fluorescenza | Leica | Modello: MZ16FA | |
| Pinza fine | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forbici, Micro forbici | |||
| Forcipe | |||
| Pinza | |||
| Greiner | piastra di Petri in plastica da 10 cm | 664160-013 | |
| Greiner | con piastra di Petri in plastica da 35 mm | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagenti per NPC coltura di dissociazione | |||
| B27 integratore | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Soluzione madre: 1 μ g/ml in 0,1% BSA/PBS |
| D-luciferina | Nacalai Tesque | 01493-85 | Soluzione madre: 100mM in soluzione salina allo 0,9% |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Soluzione madre: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Piatto con fondo in vetro | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 integratore (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetil-cisteina | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Soluzione madre: 7U/ml in EBSS |
| Penicillina/Streptmicina | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparati per elettroporazione in utero | |||
| siringa da 50 ml | TERUMO | 181228T Elettrodo | |
| Neppagene | 7 mm | ||
| Elettroporatore | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Pinze | |||
| Garze | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillare | Realizzato internamente | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Forbice | |||
| , Micro forbici | |||
| Ago da sutura | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xilazina | Bayer | Seractal | |
| Preparazioni per coltura a fette | |||
| 10 cm piastra di Petri in plastica | greiner | 664160-013 | |
| Greiner | in plastica per piastre di Petri da 35 mm | 627160 | |
| Inserto di coltura | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Siero fetale bovino | Sigma | 172012-500ML | |
| Pinze fini | DUMONT | INOX No.5 | |
| Pinze | |||
| Siero di cavallo | Gibco | 16050-122 | |
| Micro coltello chirurgico | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Incubatrice multigas | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Realizzato internamente | ref. Coltura dissociativa NPC | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pinza | |||
| Forbici, Micro forbici | |||
| Tagliere in gomma siliconica | Realizzato internamente |
Riferimenti
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
