Analisi spaziale temporale del flusso Fieldwise nella microvascolatura

Summary

Per quantificare il flusso microvascolare dalle sequenze di immagini capillari ad alta velocità, abbiamo sviluppato il software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Nell'intero campo dell'immagine e nel tempo, STAFF valuta le velocità di flusso e genera una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l'output tabulare per le analisi quantitative.

Abstract

I cambiamenti nella velocità e nella distribuzione del flusso sanguigno sono fondamentali per mantenere la perfusione di tessuti e organi in risposta a diverse esigenze cellulari. Inoltre, la comparsa di difetti nella microcircolazione può essere un indicatore primario nello sviluppo di più patologie. I progressi nell'imaging ottico hanno reso la microscopia intravitale (IVM) un approccio pratico, permettendo l'imaging a livello cellulare e subcellulare negli animali vivi ad alta velocità nel tempo. Tuttavia, nonostante l'importanza di mantenere un'adeguata perfusione dei tessuti, la variabilità spaziale e temporale nel flusso capillare è raramente documentata. Nell'approccio standard, un piccolo numero di segmenti capillari viene scelto per l'imaging in un periodo di tempo limitato. Per quantificare in modo completo il flusso capillare in modo imparziale, abbiamo sviluppato Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), una macro per il software di analisi delle immagini open source FIJI. Utilizzando sequenze di immagini ad alta velocità di campi completi del flusso sanguigno all'interno dei capillari, STAFF produce immagini che rappresentano il movimento nel tempo chiamate kymographs per ogni intervallo di tempo per ogni segmento vascolare. Dai kymographs STAFF calcola le velocità dalla distanza di spostamento dei globuli rossi nel tempo e restituisce i dati sulla velocità come una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l'output tabulare per le analisi quantitative. Nei normali fegati di topo, STAFF analizza profonde differenze di velocità di flusso tra le regioni pericentrali e periportali all'interno dei lobuli. Ancora più inaspettate sono le differenze di velocità di flusso osservate tra i sinusoidi che sono affiancati e le fluttuazioni osservate all'interno di singoli segmenti vascolari nel corso dei secondi. STAFF è un nuovo potente strumento in grado di fornire nuove intuizioni consentendo la misurazione delle complesse dinamiche spatiotemporali del flusso capillare.

Introduction

La microvascolatura svolge un ruolo fondamentale nella fisiologia, garantendo una perfusione efficace dei tessuti in condizioni mutevoli. Disfunzione microvascolare è associata a una miriade di condizioni tra cui morbilità cardiovascolare a lungo termine e mortalità, sviluppo di demenza, e malattia di fegato e rene e quindi è un fattore chiave di interesse in una vasta gamma di indagini biomediche^1,2,3,4,5. Mentre sono state utilizzate più tecniche per valutare la perfusione tissutale, solo la microscopia i....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida del Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università dell'Indiana, e hanno aderito alla guida NRC per la cura e l'uso degli animali.

1. Preparazione chirurgica per la microscopia intravitale

NOT: Questo non è un intervento di sopravvivenza. Una volta iniziata la sezione 1 "Preparazione chirurgica per la microscopia intravitale", i lavori non possono essere sospesi fino al completamento della sezione 2 "Microscopia intravitale".

1. Acclimatare 9-10 settimana-vecchio maschio C57BL/6 ....

Results

L'analisi STAFF genera un censimento completo delle velocità microvascolari su interi campi del microscopio per periodi di tempo che si estendono da secondi a minuti. I risultati rappresentativi sono presentati in Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4. La figura 1 mostra un esempio di una serie temporale della rete microvascolare nel fegato di un topo, la generazione dell'.......

Discussion

In questo protocollo sono previsti più passaggi critici. In primo luogo, la minimizzazione del movimento durante l'imaging intravitale del fegato è essenziale per generare filmati che sono utilizzabili per l'analisi del flusso capillare utilizzando STAFF. A causa della vicinanza del diaframma, si verificano brevi periodi di movimento indotta dalla respirazione, con il fegato assicurato che ritorna alla sua posizione iniziale dopo ogni respiro. Fissare il fegato a comparsa chirurgica contro la parabola dal fondo del coper.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 pinze	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 topi	Jackson Labs		maschio 9-12 settimane
Cannula	Instech	BTPE-10	Tubo in polietilene 0,011 x 0,024 pollici
Fotocamera CMOS	Hamamatsu	C11440-42U30	4.0LT Scientific CMOS
Piatto con fondo coprioggetto	Microscopia elettronica Sciences		WillCo Dish fondo in vetro GWST5040
Forbici da dissezione	Fine Science Tools
Fiji ImageJ Software			di analisi delle immagini https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Destrano di fluoresceina	Thermo Fisher, Invitrogen	D1822	Dextran, Fluoresceina, 70.000 MW, Anionico, Lisina Fissabile
Spugna di garza	Fisher	22-415-504	2x2 pollici Dukal spugne di garza sterili
Pad riscaldante	Reptitherm	RH-4	tra mouse e palco
Pad riscaldante	Sunbeam	000732-500-000U	sopra il mouse
Microscopio a epifluorescenza invertito	Nikon		Nikon TiE microscopio invertito
Isis Rasoio elettrico per roditori	Braun Aesculap	GT420
Isofluorane	Abbott GmbH	PZN4831850
Luer adattatore per tronchetto	Fisher	14-826-19E	Adattatore per catetere
Micro forbici	Castro Viejo
Obiettivo per microscopio	Nikon		Plan Fluor 20x, NA 0,75 ago ad immersione in acqua
	Fisher		30 G x1/2"
Ago supporto	Olsen-Hegar
Riscaldatore dell'obiettivo	BioScience Tools	MTC-HLS-025	Regolatore di temperatura con riscaldatore dell'obiettivo
Termometro rettale	Braintree Scientific, INC	TH-5A	Monitoraggio della temperatura corporea del topo
Macro			https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Stringa di sutura	Harvard Bioscience	723288	sutura nera in seta, 6-0, bobina