Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur
Summary
Om de microvasculaire stroom te kwantificeren uit hoge snelheid capillaire flow beeld sequenties, ontwikkelden we medewerkers (ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow) software. In het volledige afbeeldingsveld en na verloop van tijd evalueert het personeel stroomsnelheden en genereert het een reeks ruimtelijke kaarten met kleurcodering voor visualisatie en tabellaire uitvoer voor kwantitatieve analyses.
Abstract
Veranderingen in de bloedstroomsnelheid en-verdeling zijn van vitaal belang voor het behoud van weefsel-en orgaan perfusie in reactie op verschillende cellulaire behoeften. Verder kan het verschijnen van defecten in de microcirculatie een primaire indicator zijn in de ontwikkeling van meerdere pathologieën. Vooruitgang in optische beeldvorming hebben intravital microscopie (IVM) een praktische aanpak, waardoor beeldvorming op cellulair en subcellulair niveau in levende dieren op hoge snelheid na verloop van tijd. Toch wordt, ondanks het belang van het handhaven van adequate weefsel perfusie, de ruimtelijke en temporele variabiliteit in capillaire stroming zelden gedocumenteerd. In de standaardbenadering wordt gedurende een beperkte tijd een klein aantal capillaire segmenten gekozen voorbeeld vorming. Om de capillaire stroming volledig te kwantificeren op een onbevooroordeelde manier ontwikkelden we ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow (STAFF), een macro voor FIJI open-source beeldanalyse software. Met behulp van High-Speed beeld sequenties van volledige velden van de bloedtoevoer binnen de haarvaten, produceert het personeel beelden die beweging in de tijd voorstellen genaamd kymographs voor elk tijdsinterval voor elk vasculaire segment. Vanuit de kymografen berekent het personeel snelheden van de afstand die rode bloedcellen na verloop van tijd verplaatsen, en voert de snelheidsgegevens uit als een reeks kleurgecodeerde ruimtelijke kaarten voor visualisatie en in tabelvorm uitvoer voor kwantitatieve analyses. Bij normale muis levers analyseert het personeel gekwantificeerde diepgaande verschillen in stromingssnelheid tussen pericentrale en periportaalgebieden binnen lobules. Nog meer onverwachte zijn de verschillen in stromingssnelheid gezien tussen sinusoïden die naast elkaar staan en schommelingen die binnen enkele seconden in afzonderlijke vasculaire segmenten worden gezien. MEDEWERKERS is een krachtige nieuwe tool die in staat is om nieuwe inzichten te bieden door meting van de complexe spatiotemporele dynamiek van capillaire stroming mogelijk te maken.
Introduction
De Microvasculatuur speelt een cruciale rol in de Fysiologie en zorgt voor een effectieve perfusie van weefsels onder veranderende omstandigheden. Microvasculaire disfunctie wordt geassocieerd met talloze aandoeningen, waaronder langdurige cardiovasculaire morbiditeit en sterfte, ontwikkeling van dementie en ziekte van zowel de lever als de nieren en is dus een belangrijke factor van belang in een breed scala van biomedische onderzoeken1,2,3,4,5. Hoewel meerdere technieken zijn gebruikt om weefsel perfusie te evalueren, maakt alleen intravital microscopie het verzamelen van gegevens mogelijk in de temporele en ruimtelijke resolutie die nodig zijn om de bloedtoevoer op het niveau van individuele haarvaten te karakteriseren.
Microvasculaire stroming kan worden gevisualiseerd in fluorescentiemicroscopie door de beweging van fluorescerende microsferen of door de verplaatsing van rode bloedcellen tegen de achtergrond van membraan-imperbetekende fluorescerende markers (bijv. fluorescently-gelabeld dextran of albumine)6,7. Microvasculaire stroming kan worden afgebeeld in oppervlakkige cellagen met behulp van Widefield microscopie, of op diepte met behulp van confocale of multiphoton microscopie. Capillaire stroomsnelheden zijn echter zodanig dat de passage van rode bloedcellen over het algemeen niet kan worden opgevangen bij snelheden van minder dan 60 frames/s. Aangezien de meeste laser scanning confocale en multiphoton microscopen 1 – 5 s nodig hebben om een volledig afbeeldingsveld te scannen, kan deze snelheid over het algemeen alleen worden bereikt door het gezichtsveld te beperken, soms tot één scanlijn8. Het proces van het beperken van metingen tot geselecteerde capillaire segmenten (1) heeft het potentieel om selectie bias in te voeren en (2) maakt het onmogelijk om ruimtelijke en temporele heterogeniteit vast te leggen in de tarieven van capillaire bloedstroom. Daarentegen kunnen beelden van capillaire netwerken worden verzameld met snelheden van meer dan 100 fps met behulp van Widefield Digitale microscopen uitgerust met wetenschappelijke complementaire metaaloxide Semiconductor (scmos) camera’s9,10. Deze goedkope systemen, gebruikelijk in typische biomedische laboratoria, maken het mogelijk om microvasculaire stroming in hele tweedimensionale netwerken te afbeelen, in essentie continu. Het probleem wordt dan een van het vinden van een analyse aanpak die in staat is om zinvolle kwantitatieve gegevens uit de massale en complexe beeld datasets gegenereerd door High-speed video microscopie te extraheren.
Om de analyse van de volledige veld stroom gegevens in te schakelen hebben we personeel ontwikkeld, nieuwe beeldanalyse software die continu microvasculaire flow kan meten in hele Microscoop velden van beeld reeksen verzameld op hoge snelheid11. De aanpak is compatibel met een verscheidenheid aan verschillende experimentele systemen en beeldvormings modaliteiten en de beeldanalyse software van het personeel wordt geïmplementeerd als een macro-toolset voor de FIJI-implementatie van ImageJ12. Het onderliggende principe dat hier wordt gebruikt om microvasculaire stroming te visualiseren, is dat eerst enig contrast moet worden verschaft om de rode bloedcellen binnen haarvaten te kunnen afbeelden. In onze studies, contrast wordt geleverd door een bulk fluorescerende sonde die wordt uitgesloten door de rode bloedcellen. De snelheid van de stroming kan vervolgens worden gekwantificeerd van de verplaatsing van de rode bloedcellen die verschijnen als een negatieve vlek binnen het fluorescently gelabelde plasma in beelden verzameld op hoge snelheid van een levend dier8. Vervolgens gebruiken we medewerkers om een afstand te maken langs elk capillair segment over meerdere intervallen van de tijd met de naam kymographs, en detecteren vervolgens de hellingen die aanwezig zijn in de kymographs13, en van die hellingen worden de percentages van de microvasculaire stroming berekend. De aanpak kan worden toegepast op beelden die zijn verzameld van een capillair bed dat toegankelijk is voorbeeld vorming. Hier beschrijven we de toepassing van IVM en personeel aan studies van de bloedtoevoer in de lever.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn meerdere kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste, minimalisatie van de beweging tijdens intravital beeldvorming van de lever is essentieel voor het genereren van films die bruikbaar zijn voor capillaire stroming analyse met behulp van personeel. Vanwege de nabijheid van het diafragma, korte perioden van respiratie-geïnduceerde beweging optreden, met de verzekerde lever terugkeren naar de oorspronkelijke positie na elke adem. Het beveiligen van de chirurgisch blootgestelde lever tegen de dekslip-bodem schote…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De hier gepresenteerde studies werden ondersteund door de financiering van de National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 en NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital microscopie studies werden uitgevoerd in het Indiana Center voor biologische microscopie. We danken Dr. Malgorzata Kamocka voor technische assistentie bij microscopie.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
Riferimenti
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
