אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה
Summary
כדי לכמת את זרימת מיקרונימי הדם ממהירות גבוהה מהירות רצף נימי תמונה, פיתחנו צוות (ניתוח זמני מרחבי של זרימת שפילד) תוכנה. מעבר לשדה התמונה המלא ולאורך הזמן, הצוות מעריך מהירויות זרימה ומייצר רצף של מפות מרחבית בצבע לצורך הדמיה ותפוקה טבלאית עבור ניתוחים כמותיים.
Abstract
שינויים במהירות זרימת הדם והפצה חיוניים לשמירה על רקמות ואיברים בתגובה לצרכים סלולריים שונים. עוד, המראה של פגמים במיקרו מחזור יכול להיות מחוון העיקרי בפיתוח של פתווגיות מרובות. ההתקדמות בהדמיה אופטית הפכה את מיקרוסקופ הטרטל (IVM) לגישה מעשית, המתיר הדמיה ברמה התאית והתאית בבעלי חיים במהירות גבוהה לאורך זמן. ובכל זאת, למרות החשיבות של שמירה על הרקמה הנאותה, השונות המרחבית והטמפורלית בזרימה קפילר מתועדת לעיתים רחוקות. בגישה הסטנדרטית, מספר קטן של מגזרי נימים נבחרים להדמיה במשך זמן מוגבל. כדי לכמת באופן מקיף את זרימת נימי בצורה בלתי משוחדת פיתחנו בניתוח זמני מרחבי של שפילד תזרים (צוות), מאקרו עבור תוכנות הקוד הפתוח של פיג’י תוכנת ניתוח. באמצעות רצפי תמונות במהירות גבוהה של שדות מלאים של זרימת הדם בתוך נימים, צוות מייצרת תמונות המייצגות תנועה לאורך זמן הנקרא kymographs עבור כל מרווח זמן עבור כל פלח כלי דם. מצוות kymographs מחשבת המהירויות ממרחק כי בתאי הדם האדומים לנוע עם הזמן, והתפוקות את נתוני המהירות כרצף של מפות מרחבי צבע מקודד עבור ויזואליזציה ופלט טבלאי עבור ניתוחים כמותיים. בתוך כבדי העכבר הרגילים, הצוות מנתח את ההבדלים העמוקים במהירות הזרימה בין אזורי כלקרום הלב והשער הפנימי שבתוך הלובולים. אפילו יותר בלתי צפוי הם ההבדלים מהירות הזרימה לראות בין sinusoids כי הם בצד ותנודות לראות בתוך מגזרים בודדים כלי הדם לאורך שניות. הצוות הינו כלי חדש ורב עוצמה המסוגל לספק תובנות על ידי הפעלת הדינמיקה הטמפורלית המורכבת של זרימת קפילר.
Introduction
המיקרוקובלטורה ממלא תפקיד קריטי בפיזיולוגיה, ומבטיח הפריה אפקטיבית של רקמות בתנאים שמשתנים. מיקרוכלי דם תפקוד מיקרו משויך תנאים רבים כולל תחלואה וכלי דם לטווח ארוך ותמותה, פיתוח של דמנציה, ומחלות של הכבד והן הכליות ולכן הוא גורם מפתח של עניין במגוון רחב של חקירות ביו1,2,3,4,5. בעוד טכניקות מרובות נעשה שימוש כדי להעריך את הפרזיה רקמות, רק מיקרוסקופ intravital מאפשר איסוף נתונים בזמן וברזולוציה מרחבית הדרושים כדי לאפיין את זרימת הדם ברמה של נימים בודדים.
זרימה מיקרוכלי דם ניתן לדמיין במיקרוסקופיה פלואורסצנטית או על ידי התנועה של מיקרוספירות פלורסנט או על ידי התנועה של כדוריות הדם האדומות נגד הרקע של ממברנה-ציוויים סמנים פלורסנט (g., כגון תוספי התווית או אלבומין)6,7. ניתן לעשות שימוש בזרימה מיקרוסקולרית בשכבות תא שטחיות בעזרת מיקרוסקופ שטח, או לעומק באמצעות מיקרוסקופ מרובה או מיקרופוטון. עם זאת, שיעורי זרימת נימי הם כאלה כי מעבר של כדוריות הדם האדומות לא ניתן בדרך כלל להילכד במהירויות פחות מ 60 מסגרות/s. מאז ביותר בדיקת מיקוד לייזר מיקרוסקופ multiphoton דורשים 1 – 5 s כדי לסרוק את שדה התמונה מלא, מהירות זו יכולה בדרך כלל רק על ידי הגבלת שדה התצוגה, לפעמים קו סריקה אחת8. התהליך של הגבלת מדידות לפלחי נימים נבחרים (1) יש את הפוטנציאל להציג הטיית בחירה ו-2) מאפשר ללכוד את הטרוגניות המרחבי והזמני בשיעורי זרימת הדם נימי. לעומת זאת, תמונות של רשתות קפילר ניתן לאסוף במהירויות יעלה 100 fps באמצעות מיקרוסקופים דיגיטלית רחבת שדה מצויד מדעי מוליך למחצהמדעית תחמוצת מתכת (scmos)מצלמות 9,10. אלה מערכות זולות, נפוץ במעבדות ביו-רפואית טיפוסי לאפשר להזרים מיקרונימי התמונה על פני רשתות דו ממדיות שלמות, למעשה ברציפות. הבעיה אז הופך להיות אחד מציאת גישת ניתוח כי הוא מסוגל לחלץ נתונים כמותיים משמעותיים מתוך נתוני תמונה מסיבית ומורכבת שנוצרו על ידי מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה.
כדי לאפשר ניתוח של נתוני זרימה בשדה מלא פיתחנו צוות, ניתוח תמונה הרומן תוכנה שיכולה ברציפות למדוד זרימה מיקרוכלי דם בכל שדות מיקרוסקופ שלמים של סדרת תמונות שנאספו במהירות גבוהה11. הגישה מתאימה למגוון של מערכות נסיוניות ושיטות דימות שונות, ותוכנת ניתוח התמונה של הצוות מיושמת ככלי מאקרו המוגדר עבור הטמעת ה-פיג’י של ImageJ12. העיקרון הבסיסי המשמש כאן כדי להמחיש זרימה מיקרוכלי דם היא כי הראשון, יש לספק כמה ניגודיות כדי להיות מסוגל לדמות את כדוריות הדם האדומות בתוך נימים. במחקרים שלנו, ניגודיות מסופק על ידי בדיקה פלורסנט בתפזורת כי הוא נשלל על ידי כדוריות הדם האדומות. מהירות הזרימה יכול להיות לאחר מכן לכמת מן העקירה של כדוריות הדם האדומות המופיעות ככתם שלילי בתוך הפלזמה המסומן באמצעות פלואורוסקופים בתמונות שנאספו במהירות גבוהה מחיה חי8. לאחר מכן אנו משתמשים בצוות כדי ליצור חלקות של מרחק לאורך כל קטע נימי על מרווחי זמן מרובים הנקראים kymographs, לאחר מכן לזהות את המדרונות הנמצאים kymographs13, וממדרונות אלה לחשב את שיעורי הזרימה microvascular. הגישה ניתן להחיל על תמונות שנאספו מכל מיטה נימי כי ניתן לגשת להדמיה. כאן אנו מתארים את היישום של IVM ואת הצוות למחקרים של זרימת הדם בכבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, מיניטיזציה של התנועה במהלך הדמיה הקשה של הכבד הוא חיוני ליצירת סרטים הניתנים לשימוש עבור ניתוח זרימה קפילר באמצעות צוות. בשל הקרבה של הסרעפת, תקופות קצרות של תנועה המושרה נשימה מתרחשים, עם הכבד המאובטח חוזר למיקומו הראשוני אחרי כל נשימה. אבטח?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקרים שהוצגו כאן היו נתמכים על ידי מימון המכון הלאומי לבריאות (NIH U01 GM111243 ו NIH NIDDK P30 DK079312). לימודי המיקרוסקופיה שנערכו במרכז אינדיאנה למיקרוסקופיה ביולוגית. אנו מודים לדוקטור מלגורזאטה קמיקל לקבלת סיוע טכני עם מיקרוסקופ.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
Riferimenti
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
