माइक्रोवेकुल्चर में फील्डवाइज फ्लो का स्थानिक लौकिक विश्लेषण
Summary
उच्च गति केशिका प्रवाह छवि दृश्यों से सूक्ष्म संवहनी प्रवाह की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने स्टाफ (फील्डवाइज फ्लो का स्थानिक लौकिक विश्लेषण) सॉफ्टवेयर विकसित किया। पूर्ण छवि क्षेत्र में और समय के साथ, कर्मचारी प्रवाह वेग का मूल्यांकन करता है और मात्रात्मक विश्लेषण ों के लिए दृश्य और सारणीय उत्पादन के लिए रंग-कोडित स्थानिक मानचित्रों का एक अनुक्रम उत्पन्न करता है।
Abstract
अलग-अलग सेलुलर जरूरतों के जवाब में ऊतक और अंग परफ्यूजन को बनाए रखने में रक्त प्रवाह वेग और वितरण में परिवर्तन महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, माइक्रोसर्कुलेशन में दोषों की उपस्थिति कई विकृतियों के विकास में एक प्राथमिक संकेतक हो सकती है। ऑप्टिकल इमेजिंग में प्रगति ने इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) को एक व्यावहारिक दृष्टिकोण बनाया है, जो समय के साथ उच्च गति पर जीवित जानवरों में सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर पर इमेजिंग की अनुमति देता है। फिर भी, पर्याप्त ऊतक परफ्यूजन बनाए रखने के महत्व के बावजूद, केशिका प्रवाह में स्थानिक और लौकिक परिवर्तनशीलता शायद ही कभी प्रलेखित है । मानक दृष्टिकोण में, सीमित समय में इमेजिंग के लिए कम संख्या में केशिका खंडों को चुना जाता है। निष्पक्ष तरीके से केशिका प्रवाह की व्यापक मात्रा निर्धारित करने के लिए हमने फील्डवाइज फ्लो (स्टाफ) का स्थानिक लौकिक विश्लेषण विकसित किया, फिजी ओपन-सोर्स छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक मैक्रो। केशिकाओं के भीतर रक्त प्रवाह के पूर्ण क्षेत्रों के उच्च गति छवि दृश्यों का उपयोग करना, कर्मचारी ऐसी छवियों का उत्पादन करते हैं जो हर संवहनी खंड के लिए हर समय अंतराल के लिए काइमोग्राफ नामक समय के साथ गति का प्रतिनिधित्व करते हैं। kymographs से स्टाफ दूरी है कि लाल रक्त कोशिकाओं को समय के साथ कदम से वेग की गणना करता है, और रंग के एक अनुक्रम के रूप में वेग डेटा आउटपुट-दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सारणीबद्ध उत्पादन के लिए स्थानिक नक्शे कोडित । सामान्य माउस यकृत में, कर्मचारी लोबुलके के भीतर पेरिसेंट्रल और पेरिपोर्टल क्षेत्रों के बीच प्रवाह वेग में मात्रानिर्धारित गहन अंतर का विश्लेषण करता है। इससे भी अधिक अप्रत्याशित प्रवाह वेग में अंतर है जो सिनोसॉइड के बीच देखा जाता है जो साथ-साथ होते हैं और सेकंड में व्यक्तिगत संवहनी खंडों के भीतर देखे गए उतार-चढ़ाव होते हैं। स्टाफ एक शक्तिशाली नया उपकरण है जो केशिका प्रवाह की जटिल स्थानिक गतिशीलता की माप को सक्षम करके उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम है।
Introduction
माइक्रोवेकुल्चर शरीर विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बदलती परिस्थितियों में ऊतकों के प्रभावी perfusion सुनिश्चित करने । माइक्रोवैस्कुलर डिसफंक्शन दीर्घकालिक हृदय रुग्णता और मृत्यु दर, डिमेंशिया का विकास, और यकृत और गुर्दे दोनों की बीमारी सहित असंख्य स्थितियों से जुड़ा हुआ है और इस प्रकार जैव चिकित्सा जांच1,2,3,4,5की एक विस्तृत श्रृंखला में रुचि का एक प्रमुख कारक है। जबकि ऊतक परफ्यूजन का मूल्यांकन करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया गया है, केवल इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत केशिकाओं के स्तर पर रक्त प्रवाह की विशेषता के लिए आवश्यक लौकिक और स्थानिक संकल्प पर डेटा संग्रह को सक्षम बनाता है।
माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी में या तो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर के आंदोलन से या झिल्ली-अभेद्य फ्लोरोसेंट मार्कर (जैसे, फ्लोरोसेंट-लेबल ्ड्टिन या एल्बुमिन)6,7की पृष्ठभूमि के खिलाफ लाल रक्त कोशिकाओं के आंदोलन से कल्पना की जा सकती है। माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सतही कोशिका परतों में या या तो कॉन्फोकल या मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गहराई से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, केशिका प्रवाह दर ऐसी है कि लाल रक्त कोशिकाओं के पारित होने को आम तौर पर ६० फ्रेम/एस से कम गति पर नहीं पकड़ा जा सकता है । चूंकि अधिकांश लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल और मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप को पूर्ण छवि क्षेत्र को स्कैन करने के लिए 1-5 एस की आवश्यकता होती है, इसलिए इस गति को आम तौर पर केवल देखने के क्षेत्र को सीमित करके पूरा किया जा सकता है, कभी-कभी एक स्कैन लाइन8तक। चयनित केशिका खंडों (1) के लिए माप को सीमित करने की प्रक्रिया में चयन पूर्वाग्रह लागू करने की क्षमता है और (2) केशिका रक्त प्रवाह की दरों में स्थानिक और लौकिक विषमता को पकड़ने के लिए असंभव बनाता है। इसके विपरीत, वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (sCMOS) कैमरों9,10से लैस वाइडफील्ड डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 100 एफपीएस से अधिक की गति पर केशिका नेटवर्क की छवियों को एकत्र किया जा सकता है। ये सस्ती प्रणालियां, ठेठ जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में आम हैं, जो अनिवार्य रूप से लगातार पूरे दो-आयामी नेटवर्क में माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को छवि बनाती हैं। समस्या तो एक विश्लेषण दृष्टिकोण है कि बड़े पैमाने पर और जटिल छवि उच्च गति वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पन्न डेटासेट से सार्थक मात्रात्मक डेटा निकालने में सक्षम है खोजने में से एक बन जाता है ।
पूर्ण क्षेत्र प्रवाह डेटा के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए हमने स्टाफ, उपन्यास छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो उच्च गति11पर एकत्र की गई छवि श्रृंखला के पूरे माइक्रोस्कोप क्षेत्रों में माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को लगातार माप सकता है। दृष्टिकोण विभिन्न प्रयोगात्मक प्रणालियों और इमेजिंग तौर-तरीकों की एक किस्म के साथ संगत है और स्टाफ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को इमेजजे12के फिजी कार्यान्वयन के लिए मैक्रो टूलसेट के रूप में लागू किया जाता है। सूक्ष्म संवहनी प्रवाह की कल्पना करने के लिए यहां उपयोग किया जाने वाला अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि पहले, केशिकाओं के भीतर लाल रक्त कोशिकाओं को छवि बनाने में सक्षम होने के लिए कुछ विपरीत प्रदान किया जाना चाहिए। हमारे अध्ययनों में, इसके विपरीत एक थोक फ्लोरोसेंट जांच द्वारा प्रदान किया जाता है जिसे लाल रक्त कोशिकाओं द्वारा बाहर रखा गया है। इसके बाद प्रवाह के वेग को लाल रक्त कोशिकाओं के विस्थापन से प्राप्त किया जा सकता है जो जीवित पशु8से अत्यधिक गति से एकत्र की गई छवियों में फ्लोरोसेंटी लेबल प्लाज्मा के भीतर नकारात्मक दाग के रूप में दिखाई देते हैं । फिर हम कर्मचारियों का उपयोग केमोग्राफ नामक समय के कई अंतरालों पर प्रत्येक केशिका खंड के साथ दूरी के भूखंड बनाने के लिए करते हैं, फिर किमोग्राफ13में मौजूद ढलानों का पता लगाते हैं, और उन ढलानों से माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह की दरों की गणना करते हैं। दृष्टिकोण इमेजिंग के लिए पहुँचा जा सकता है कि किसी भी केशिका बिस्तर से एकत्र छवियों पर लागू किया जा सकता है। यहां हम जिगर में रक्त प्रवाह के अध्ययन के लिए आईवीएम और कर्मचारियों के आवेदन का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, जिगर की इंट्राग्लइमेजिंग के दौरान गति को कम करना उन फिल्मों को पैदा करने के लिए आवश्यक है जो कर्मचारियों का उपयोग करके केशिका प्रवाह विश्लेषण के लिए ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां प्रस्तुत अध्ययनों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच U01 GM1111243 और NIH NIDDK P30 DK079312) से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था । इंडियाना सेंटर फॉर बायोलॉजिकल माइक्रोस्कोपी में इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी अध्ययन किए गए। हम माइक्रोस्कोपी के साथ तकनीकी सहायता के लिए डॉ माल्गोर्जेटा कामॉका को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
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