Spatial temporal analys av fältvis flöde i Mikrovaskulatur
Summary
För att kvantifiera mikrovaskulära flödet från hög hastighet kapillär flöde bildsekvenser, vi utvecklade personal (spatial temporal analys av Fieldwise Flow) programvara. I hela bildfältet och över tid utvärderar personal flödeshastigheter och skapar en sekvens av färgkodade rumsliga mappningar för visualisering och tabellutdata för kvantitativa analyser.
Abstract
Förändringar i blodflödet hastighet och fördelning är avgörande för att upprätthålla vävnad och organ perfusion som svar på varierande cellulära behov. Vidare kan uppkomsten av defekter i mikrocirkulationen vara en primär indikator i utvecklingen av flera patologier. Framsteg inom optisk avbildning har gjort intravital mikroskopi (IVM) ett praktiskt tillvägagångssätt, vilket möjliggör avbildning på den cellulära och subcellulära nivå i levande djur vid hög hastighet över tid. Men, trots vikten av att upprätthålla adekvat vävnad perfusion, rumsliga och temporala variationer i kapillärflöde är sällan dokumenterat. I standardmetoden väljs ett litet antal kapillärsegment för avbildning under en begränsad tid. För att utförligt kvantifiera kapillärflödet i en opartisk sätt vi utvecklat spatial temporal analys av Fieldwise Flow (personal), ett makro för FIJI öppen källkod bildanalysprogram vara. Med hjälp av hög hastighet bildsekvenser av hela fält av blodflödet inom kapillärer, personal producerar bilder som representerar rörelse över tiden kallas kymographs för varje tidsintervall för varje vaskulär segment. Från kymographs personal beräknar hastigheter från det avstånd som röda blodkroppar rör sig över tiden, och matar ut hastighetsdata som en sekvens av färgkodade rumsliga kartor för visualisering och tabellutdata för kvantitativa analyser. I normal mus lever, personal analyser kvantifierade djupgående skillnader i flödet hastighet mellan pericentral och periportal regioner inom lobules. Ännu mer oväntade är skillnaderna i flödeshastighet ses mellan sinusoider som är sida vid sida och variationer ses inom enskilda vaskulära segment över sekunder. PERSONAL är ett kraftfullt nytt verktyg som kan ge nya insikter genom att möjliggöra mätning av den komplexa spatiotemporal dynamiken i kapillärflödet.
Introduction
Mikrovaskulaturen spelar en avgörande roll i fysiologi, vilket säkerställer effektiv perfusion av vävnader under förändrade förhållanden. Microvascular dysfunktion är förknippad med otaliga villkor inklusive långsiktig kardiovaskulär morbiditet och dödlighet, utveckling av demens, och sjukdom av både lever och njure och därmed är en viktig faktor i ett brett spektrum av biomedicinska undersökningar1,2,3,4,5. Medan flera tekniker har använts för att utvärdera vävnad perfusion, endast intravital mikroskopi möjliggör datainsamling vid den temporala och rumsliga upplösning som krävs för att karakterisera blodflödet på nivån för enskilda kapillärer.
Mikrovaskulära flödet kan visualiseras i fluorescens mikroskopi antingen genom förflyttning av fluorescerande mikrosfärer eller genom förflyttning av röda blodkroppar mot bakgrund av membran-oreglerade fluorescerande markörer (t. ex., fluorescently-märkt dextran eller albumin)6,7. Mikrovaskulära flödet kan avbildas i ytliga cellskikt med hjälp av widefield mikroskopi, eller på djupet med antingen konfokal eller multiphoton mikroskopi. Kapillärflödet är dock sådant att passage av röda blodkroppar i allmänhet inte kan fångas i hastigheter mindre än 60 frames/s. Eftersom de flesta laserskanning konfokala och multiphoton Mikroskop kräver 1-5 s för att skanna en hel bild fält, kan denna hastighet i allmänhet endast åstadkommas genom att begränsa synfält, ibland till en enda scan linje8. Processen för att begränsa mätningar till utvalda kapillärsegment (1) har potential att införa val bias och (2) gör det omöjligt att fånga rumsliga och temporala heterogenitet i de satser av kapillär blodflödet. Bilder av kapillärnät kan däremot samlas in i hastigheter över 100 fps med hjälp av widefield digitala Mikroskop utrustade med vetenskapliga komplementära metalloxid halvledare (sCMOS) kameror9,10. Dessa billiga system, vanligt i typiska biomedicinska laboratorier gör det möjligt att bilden mikrovaskulära flödet över hela tvådimensionella nätverk, i huvudsak kontinuerligt. Problemet blir då en av att hitta en analysmetod som kan utvinna meningsfulla kvantitativa data från den massiva och komplexa bild dataset som genereras av Höghastighetsvideo mikroskopi.
För att möjliggöra analys av full-Field Flow data vi har utvecklat personal, ny bildanalysprogram vara som kontinuerligt kan mäta mikrovaskulära flödet i hela mikroskopfält av bildserie som samlats in vid hög hastighet11. Tillvägagångssättet är förenligt med en mängd olika experimentella system och Imaging modaliteter och personal bildanalysprogram implementeras som ett makro verktygsuppsättning för FIJI genomförandet av ImageJ12. Den bakomliggande princip som används här för att visualisera mikrovaskulära Flow är att först, viss kontrast måste ges för att kunna bild de röda blodkropparna i kapillärerna. I våra studier, kontrast tillhandahålls av en bulk fluorescerande sond som utesluts av de röda blodkropparna. Hastigheten av flödet kan sedan kvantifieras från förskjutningen av de röda blodkropparna som visas som en negativ fläck inom fluorescerande märkta plasma i bilder som samlats in med hög hastighet från ett levande djur8. Vi använder sedan personal för att göra tomter på avstånd längs varje kapillär segment över flera tidsintervall av tid som kallas kymographs, sedan upptäcka backarna som finns i kymographs13, och från dessa sluttningar beräkna frekvensen av mikrovaskulära flödet. Tillvägagångssättet kan tillämpas på bilder som samlats in från någon kapillär säng som kan nås för avbildning. Här beskriver vi tillämpningen av IVM och personal till studier av blodflödet i levern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska steg i det här protokollet. Första, minimering av rörelse under intravital avbildning av levern är viktigt för att generera filmer som är användbara för kapillärflöde analys med hjälp av personal. På grund av närheten av membranet, korta perioder av andning-inducerad rörelse inträffar, med säkrade levern återvänder till sitt ursprungliga läge efter varje andetag. Att säkra den kirurgiskt exponerade levern mot täckglasbottnad skålen med hjälp av gasväv, sedan Imaging underi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studier som presenteras här stöddes av finansiering från National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 och NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital mikroskopi studier utfördes vid Indiana centrum för biologisk mikroskopi. Vi tackar Dr Malgorzata Kamocka för teknisk assistans med mikroskopi.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
Riferimenti
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
