NF-ЗБ-зависимых Люцифераза Активация и количественная экспрессия генов в сальмонеллы инфицированных тканей культуры клеток

Summary

Здесь мы представляем протокол для быстрого и легкого измерения ядерного фактора каппа-свет-цепной-усилитель активированных В-клеток (NF-ЗБ) активации в клеточных линиях, выражающих NF-ЗВ::luciferase репортер строит, с помощью измерений люминесценции в клеточном лисате. Кроме того, экспрессия генов определяется с помощью RT-qPCR, изолированного из клеток, инфицированных Salmonella Typhimurium.

Abstract

Димерический транскрипционный фактор NF-ЗБ регулирует многие клеточные пути реагирования, в том числе воспалительные пути, вызывая выражение различных цитокинов и хемокин. NF-ЗB является составно выражена и поглощена цитозолом ингибирующим белковым ядерным фактором усилителя полипептидного гена каппа в ингибиторе В-клеток, альфа (I-B). Активация НФ-ЗБ требует деградации ИЗБЗ, который затем выставляет сигнал ядерной локализации на NF-QB и способствует его обороту в ядро. Попав в ядро, НФ-ЗБ связывается с промоторной областью генов NF-ЗБ, таких как интерлейкин 6 (IL-6) и IL-23, чтобы способствовать их выражению.

Активация НФ-КБ происходит независимо от транскрипции или перевода. Таким образом, состояние активации NF-ЗB должно измеряться либо количественной оценкой NF-‘S B конкретно в ядре, либо количественной экспрессией генов цели NF-NB. В этом протоколе клетки, зависшие с помощью NF-ЗБ::luciferase репортер асссы для активации NF-ЗБ с использованием методов культуры тканя in vitro. Эти клетки заражены Salmonella Typhimurium для активации NF-ЗВ, который прогуливается к ядру и связывается с местами ЗБ в области промотора люциферазы, вызывая его выражение. Клетки лизаны и проанализированы с помощью системы анализа люциферазы. Количество люциферазы, вырабатываемой клетками, коррелирует с интенсивностью люминесценционного сигнала, который обнаруживается считывателем пластин. Люминесценционный сигнал, генерируемый этой процедурой, обеспечивает быстрый и высокочувствительный метод оценки активации NF-ЗВ в различных условиях. Этот протокол также использует количественную обратную транскрипцию PCR (RT-qPCR) для обнаружения относительных уровней мРНК, которые свидетельствуют о экспрессии генов.

Introduction

Семейство белков, обладающие ядерным фактором-ЗБ (NF-), являются важными активаторами транскрипции, которые регулируют экспрессию генов различными биологическими путями. Активация NF-ЗB индуцирует транскрипцию генов-мишеней, многие из которых важны для иммунных и воспалительных реакций, пролиферации клеток, реакции на стресс и прогрессирование рака^1,2. НФ-ЗБ играет важную роль в посредничестве ранних воспалительных исходов для очистки патогенов. Учитывая многочисленные биологические процессы, при посредничестве активации НФ-ЗБ, сбои в ее сигнализации могут иметь серьезные последствия для здоровья и болезней. Потеря функциональных мутаций в сигнализации NF-ЗБ связана с несколькими фенотипами иммунодефицита, в то время как увеличение функциональных мутаций связано с несколькими типами рака, включая В-клеточные лимфомы и рак^{молочной}железы 3 . Кроме того, было показано, что многие патогенные микроорганизмы непосредственно модулируют состояние активации NF-Q B через выражение факторов вирулентности^4,5,6,7.

Активация НФ-ЗБ, как известно, является следствием многих переменных стимулов, включая бактериальные продукты, такие как липополисахариды (LPS), флагеллин и пептидогликан, известные как патогенные молекулярные модели (PAMP). Эти PAMPs обнаруживаются рецепторами распознавания образов (PRRs), такими как платные рецепторы (TLRs) и Нод-подобные рецепторы (NLRs), что приводит к активации NF-ЗВ и последующему выражению массива NF-‘B-зависимых воспалительных генов⁸. В дополнение к активации PRR PAMPs, другие бактериальные продукты, такие как бактериальные эффекторные белки, могут вызвать активацию NF-ЗВ. Интересно, что бактерии также выражают эффекторные белки, которые активно утихают путь NF-ЗB и повышают их патогенность, подчеркивая важность NF-ЗВ как важного посредника иммунитета⁹.

Есть пять различных подразделений, которые образуют Димы NF-‘B; p50, p52, RelA (p65), RelB и cRel. Двумя основными гетеродимами НФ-КБ являются p50:RelA и p52:RelB dimers. Активированные димеры NF-‘B связываются с участками ДНК, известными как участки ЗБ, в области промотора и усилителя различных генов-мишеней. При нормальных гомеостатических условиях, NF-ЗБ взаимодействует с семейством ингибирующих белков, известных как белки I’B, чтобы оставаться неактивными. При стимуляции, I’B фосфорилируется ИКБ Кинасе (IKK), что позволяет ему быть мишенью для повсеместности, а затем деградации. Деградация ИЗБ активирует NF-ЗБ, показывая сигнал ядерной локализации. Затем НФ-ЗБ перемещается в ядро, где связывает участки ЗБ в области промоториков генов-мишеней и способствует транскрипции¹⁰. Таким образом, активация NF-ЗB upregulates mRNA выражение NF-ЗБ целевых генов, и это изменение может быть измерено с помощью РНК количественной ассы, такие как RT-qPCR¹¹.

Существует несколько методов, которые обычно используются для измерения активации NF-ЗВ, включая анализы смещения электрофоретической подвижности (EMSA), транслокацию ядерного оружия и анализы репортеров генов. EMSA используется для обнаружения белковых комплексов с нуклеиновыми кислотами. Стимулированные клетки фракционируются для изоляции ядерных белков, включая трансумизированный NF-NB, который затем инкубируется радиомаркированными нуклеотидами, содержащими связующий домен NF-‘B. Образцы работают на геле и сображаются на авторрадиографию ³²P-маркировки нуклеиновой кислоты. Если НФ-ЗБ присутствует в белковой фракции, он свяжет нуклеотиды, которые будут мигрировать медленнее через гель и будут представляться в виде дискретных полос. Ядерные фракции клеток, не обладающих активированным NF-ЗB (например, нестимулированные контрольные элементы) не будут производить полос, поскольку нуклеотиды мигрируют быстрее к концу геля. Основным недостатком этого метода является то, что он в значительной степени количественный в двоичном смысле (т.е. в выключенном или выключенном) и не отражает должным образом значимых различий в связывающей способности NF-ЗБ. Кроме того, этот метод не учитывает структуры хроматина, которые функционально важны для генов nF-ЗB^12,13.

Как и в предыдущем методе, существует «несдвигающийся» асссе, в котором многоколодцные пластины покрыты нуклеотидами, содержащими связывающую последовательность NF-ЗБ. После обработки клеток ядерными фракциями белка, NF-ЗВ будет связываться с нуклеотидами, связанными с колодцем. Затем добавляются антитела против NF-‘B, которые будут взаимодействовать с связанным NF-NB и производить колоритный сигнал, пропорциональный количеству NF-‘B, указывая степень активации NF-‘B. Этот метод является выгодным по сравнению с EMSA в том, что он не требует радиомаркировки нуклеиновые кислоты и является количественным, в сравнении. Тем не менее, предостережение этого метода является то, что он снова не различает хроматин состояния NF-ЗB целевых генов¹⁴.

Другим методом, с помощью которого может быть обнаружена активация НФ-ЗВ, является иммунопрецилатация хроматина (ЧИП), при котором ДНК и взаимодействующие белки связаны между собой формальдегидом и иммунопреципицидом с конкретными антителами анти-НФ-ЗБ. Специфические фрагменты нуклеотидов затем очищаются и идентифицируются с помощью усиления ПЦР или прямого секвенирования высокой пропускной способности. Результаты, полученные от этого метода, дают полуколичественные результаты связывающей активности NF-ЗB с генами-мишени. Тем не менее, результаты сильно зависят от условий фиксации и процессов очистки на каждом шагу^15.

В ядерных транслокационных анализах клетки стимулируются, чтобы вызвать активацию NF-‘B, а затем фиксироваться. Анти-p65 антитела добавляются в фиксированные клетки. Кроме того, само подразделение p65 может быть помечено флуоресцентным пептидом, таким как зеленый флуоресцентный зеленый (GFP). В любом случае, иммунофлуоресценция позволит визуализации локализации p65 для определения клеточного распределения. Измеряя долю цитосолильного и ядерного локализованного белка, исследователи могут определить относительное состояние активации NF-ЗБ. Недостатком этого метода является то, что иммунофлуоресценция сравнительно отнимает много времени, требует дорогостоящих антител и требует относительно большей технической экспертизы^16.

Репортер гены обычно используются инструменты для изучения нормативных и экспрессии моделей гена интереса. Как правило, гены репортеров строятся из промоторной последовательности гена, интересующего его, слитого в кодирование генов для легко обнаруживаемого белка. Белки с ферментативной деятельностью, флуоресценцией или люминесценцией обычно выбираются для их способности анализироваться и количественно осваиваться. Таким образом, считывание (например, люминесценция, флуоресценция) служит сигналом для обнаружения экспрессии гена. Эти конструкции репортера могут быть введены в различные типы клеток, такие как эпителиальные клетки или макрофаги.

Описанным в протоколе является использование клонированной линии клеток HeLa (HeLa 57A), которая заглушается лучиферазы репортер, содержащий три копии консенсуса в области иммуноглобулина и цепи промоутер^{а 17}. Выражение люциферазы зависит от активации NF-ЗБ, которая происходит после стимуляции клеток. Стимулированные клетки легко лизаются с помощью буфера лиза клетки, предусмотренного в наборе для проверки люциферазы. Часть клеточного лизата затем смешивается с люциферазы ассеа буфер, который содержит люциферин. Люциферин является субстратом люциферазы и необходим для генерации света в присутствии люциферазы. После объединения буфера ассеса с лизатом, решение будет излучать свет в процессе, известном как люминесценция. Количество света, производимого в люменах, пропорционально количеству люциферазы, присутствующее в лисате, и служит мерой активации NF-ЗБ. Показания люмюна интерпретируются по сравнению с нестимулированным стандартом для учета исходной активности NF-ЗВ, а сам сигнал стабилен в течение нескольких минут, что позволяет обеспечить надежное измерение. Кроме того, линия клеток HeLa 57A заглушается репортером NF-qB-независимого з-галактозидаза. Репортер з-галактозидаза является constitutively выражена, и активность в й-галактозидазе может быть измерена для контроля жизнеспособности клеток или изменения в количестве клеток^17. Значения люциферазы затем могут быть скорректированы с учетом значений з-галактозидаза и сообщены как увеличение раза по сравнению с нестимулированными контрольными клетками.

Поскольку NF-ЗB является транскрипционным фактором, ответственным за повышение экспрессии nF-‘sB-зависимых целевых генов, последующий эксперимент по контролю за nF-‘SB-зависимым повышенным экспрессией генов является количественную обратную реакцию транскрипции полимеразной цепи ( RT-qPCR). RT-qPCR является высокочувствительным методом, с помощью которого изменения в экспрессии генов могут быть количественно в течение нескольких порядков величины. Стимулированные и контрольные клетки собирают для РНК через экстракцию фенола-хлороформа. После фазового разделения РНК извлекается в качестве основного компонента ваквого слоя. РНК затем осаждается и промывается для получения чистого гранулы. Этот гранулы затем воссозданы и дальнейшего очищены от загрязняющих ДНК с помощью лечения DNase. Чистая РНК затем обратное транскрибируется для создания дополнительной ДНК (кДНК). Это cDNA может быть проанализировано с помощью количественных методов ПЦР, где обилие конкретной последовательности мРНК количественно определить экспрессию генов. Этот метод не разъясняет трансляционный контроль, пост трансляционную модификацию, изобилие белков или белковую активность. Тем не менее, многие гены, особенно те, которые участвуют в провоспалительных процессах, регулируются через NF-ЗB и их изобилие мРНК свидетельствует об их выражении.

Предложенный здесь метод использует быстрый и простой способ, с помощью которого активация NF-ЗБ может быть обнаружена с помощью люминесценционных анализов клеточного лизата. RT-qPCR экспрессии гена NF-QB может быть использован для количественной оценки экспрессии определенных генов, а также для проверки функциональной активности активации NF-ЗB. Основными преимуществами такой системы являются ее простота и скорость, что позволяет высокой пропускной состав скрининга ряда условий, которые модулируют активацию NF-ЗВ. Этот протокол подходит для других клеточных линий, выражающих NF-ЗБ::luciferase репортер, и было продемонстрировано в стабилизированных RAW264.7 клеток¹⁸. Количество времени, необходимого для обработки образцов, начиная от клеточного лиза до генерации люминесценции сигнала, является минимальным и занимает промежуток около часа. Для измерения NF-ЗБ требуется только базовое лабораторное оборудование, такое как непрозрачные пластины, считыватель пластин, способный измерять люминесценцию, и простое программное обеспечение для анализа данных, такое как программа электронных таблиц.

Protocol

1. Перевалка и посев наячки Поддерживать клетки HeLa 57A в колбе 75 см2, содержащей 10 мл модифицированных носителей Орла Dulbecco (DMEM), дополненных 5% теплоинактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) при температуре 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора. А?…

Representative Results

Описанный здесь ассей фокусируется на активации транскрипционного фактора NF-ЗБ с помощью репортера, зависимого от NF-ЗБ luciferase, который заступился в линию клеток HeLa. Активированный NF-ЗБ переносится в ядро, где он связывает связывающие участки генов-мишеней, включая пров…

Discussion

Основной вклад описанного протокола заключается в том, что он обеспечивает быстрый и простой метод обнаружения активации NF-ЗB в клетках, что позволяет проводить анализ высокой пропускной активности нескольких стимулирующих состояний или препаратов, влияющих на активацию NF-ЗВ. Здесь м?…

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate