NF-κB-الاعتماد علي التنشيط والتقدير الكمي للتعبير الجيني في خلايا الانسجه المصابة السالمونيلا الثقافة
Summary
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول بسرعة وسهوله قياس العامل النووي كابا-ضوء سلسله-محسن من الخلايا المنشطة ب (NF-κB) التنشيط في خطوط الخلايا التعبير عن NF-κB:: يبني مراسل luciferase ، عن طريق قياسات التلالؤ في الخلية lysate. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تحديد التعبير الجيني عن طريق RT-qPCR معزولة عن الخلايا المصابة السالمونيلا التيفوئيد.
Abstract
وينظم عامل النسخ ديميريك NF-κB العديد من مسارات الاستجابة الخلوية ، بما في ذلك المسارات التهابيه عن طريق الحث علي التعبير عن مختلف السايتوكينات والكيمياء الكيميائية. وأعرب عن الدستورية NF-κb ويتم عزله في عصارة من البروتين المثبطة عامل النووية من كابا الخفيفة ببتيد الجينات محسن في المانع الخلايا ب ، الفا (iκbα). تفعيل NF-κB يتطلب تدهور IκBα ، والذي يكشف بعد ذلك اشاره التعريب النووي علي NF-κB ويعزز الاتجار بها إلى النواة. مره واحده في النواة ، NF-κB يربط إلى المنطقة بروموتور من NF-κB الجينات المستهدفة مثل انترلوكين 6 (آيل-6) و IL-23 ، لتعزيز التعبير عنها.
يحدث تنشيط NF-κB بشكل مستقل عن النسخ أو الترجمة. لذلك ، يجب ان يتم قياس حاله التنشيط NF-κB اما عن طريق التحديد الكمي NF-κB بشكل خاص في النواة ، أو عن طريق قياس التعبير عن الجينات الهدف NF-κB. في هذا البروتوكول ، والخلايا بشكل ثابت مع NF-κB:: تم التهاوي بناء مراسل luciferase ل NF-κB التنشيط باستخدام في المختبر تقنيات ثقافة الانسجه. يتم أصابه هذه الخلايا مع السالمونيلا التيفوئيد لتنشيط NF-κb ، الذي يتاجر إلى النواة ويربط إلى المواقع κb في منطقه المروج من luciferase ، مما يحفز التعبير عنها. يتم فحص الخلايا وتحليلها مع نظام مقايسة لوسيفيراز. يرتبط مقدار لوسيفيراز التي تنتجها الخلايا مع كثافة اشاره التلالؤ ، والتي يتم الكشف عنها من قبل قارئ لوحه. توفر اشاره التلالؤ الناتجة عن هذا الاجراء طريقه سريعة وحساسة للغاية لتقييم التنشيط NF-κB ضمن مجموعه من الشروط. يستخدم هذا البروتوكول أيضا النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) للكشف عن مستويات mRNA النسبية التي تدل علي التعبير الجيني.
Introduction
العامل النووي-κB (نف-κB) الاسره من البروتينات هي المنشطات النسخ الهامه التي تنظم التعبير الجيني في مختلف المسارات البيولوجية. تنشيط NF-κb يدفع النسخ من الجينات المستهدفة ، والعديد منها مهمة للاستجابات المناعية والتهابيه ، وانتشار الخلايا ، والاستجابات الإجهاد والسرطان التقدم1،2. NF-κB يلعب دورا أساسيا في التوسط في النتائج التهابيه المبكرة لأزاله الممرض. النظر إلى العمليات البيولوجية العديدة التي توسط فيها NF-κB التنشيط ، يمكن ان يكون للاضطرابات في الإشارات لها عواقب وخيمه علي الصحة والمرض. فقدان الطفرات وظيفة في NF-κB الإشارات المرتبطة في العديد من الظواهر الظاهرية نقص المناعة ، في حين يرتبط كسب الطفرات وظيفة مع عده أنواع من السرطانات ، بما في ذلك الأورام اللمفاوية الخلية B وسرطان الثدي3. بالاضافه إلى ذلك, وقد ثبت العديد من مسببات الامراض لتعدل مباشره حاله التنشيط NF-κb من خلال التعبير عن عوامل الضراوة4,5,6,7.
ومن المعروف ان تنشيط NF-κB لتكون نتيجة للعديد من المحفزات المتغيرة بما في ذلك المنتجات البكتيرية مثل الليبووليساشاريدس (LPS) ، والصواري والتي تعرف باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs). يتم الكشف عن هذه PAMPs بواسطة مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل مستقبلات الأرقام مثل (TLRs) ومستقبلات شبيهه بالإيماءات (NLRs) مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB والتعبير اللاحق لمجموعه من الجينات التهابيه NF-κB المعتمدة8. بالاضافه إلى التنشيط PRR من قبل PAMPs ، المنتجات البكتيرية الأخرى ، مثل البروتينات البكتيرية المستجيب ، يمكن ان تحفز تنشيط NF-κB. ومن المثير للاهتمام ، والبكتيريا أيضا التعبير عن البروتينات المستجيب الذي يخفف بنشاط NF-κB المسار وتعزيز الامراضيهم ، مما يؤكد علي اهميه NF-κB كوسيط أساسي للحصانة9.
هناك خمس وحدات فرعيه مختلفه التي تشكل الدمامل NF-κB ؛ p50 ، p52 ، ريلا (p65) ، RelB و cRel. الرئيسيتين NF-κB المتغايرة هي p50: ريلا و p52: الدمامل RelB. المنشطات NF-κB تنشيط ربط إلى مواقع الحمض النووي ، والمعروفة باسم المواقع κB ، في المروج ومحسن المناطق من الجينات المستهدفة المختلفة. في ظل ظروف التماثل الطبيعي ، يتفاعل NF-κB مع عائله من البروتينات المثبطة المعروفة باسم بروتينات IκB لتبقي غير نشطه. عند التحفيز ، فان IκB هو الفوسفارلاتيد من قبل كيناز IκB (IKK) ، والذي يسمح لها ان تكون مستهدفه للابده ، وبعد ذلك تدهور. التحلل من IκB ينشط NF-κB عن طريق الكشف عن اشاره التعريب النووي. NF-κB ثم ينتقل إلى النواة ، حيث انه يربط مواقع κB في منطقه المروج من الجينات المستهدفة وتعزيز النسخ10. التالي ، تفعيل nf-κb اوبريجولاتيس mrna التعبير عن الجينات الهدف nf-κb ، ويمكن قياس هذا التغيير من خلال اختبارات التحديد الكمي RNA مثل RT-qpcr11.
توجد عده طرق وتستخدم عاده لقياس التنشيط NF-κB ، بما في ذلك اختبارات تحول التنقل الكهربي (EMSA) ، والنقل النووي ، واختبارات مراسل الجينات. يستخدم EMSA للكشف عن مجمعات البروتين مع الأحماض النووية. يتم تجزئه الخلايا المحفزة لعزل البروتينات النووية ، بما في ذلك NF-κB ، الذي يتم احتضانه بعد ذلك مع نوكليوتيد الشعاعية التي تحتوي علي مجال ربط NF-κB. يتم تشغيل العينات علي هلام والتي تصوير عن طريق أوتوغرافي من 32P-المسمي الحمض النووي. إذا NF-κB موجود في جزء البروتين ، فانه سيتم ربط النيوبوتيدس ، والتي سوف تهاجر إبطا من خلال هلام والحاضر والعصابات المنفصلة. الكسور النووية من الخلايا التي تفتقر إلى تنشيط NF-κB (علي سبيل المثال ، خلايا التحكم غير المحفزة) سوف تنتج اي عصابات كما نوكليوديس تهاجر بشكل أسرع إلى نهاية الهلام. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو انه من الناحية الكمية إلى حد كبير في الحس الثنائي (اي ، أو إيقاف تشغيله) ولا يلتقط بشكل كاف اختلافات ذات مغزى في القدرة الملزمة NF-κB. بالاضافه إلى ذلك ، لا يعتبر هذا الأسلوب بنيات الكروماتين الهامه وظيفيا NF-κb الهدف الجينات12,13.
وعلي غرار الطريقة السابقة ، هناك اختبار “عدم التحول” الذي يتم فيه تغليف لوحات البئر المتعددة بالنواة التي تحتوي علي تسلسل الربط NF-κB. بعد العلاج من الخلايا مع الكسور النووية من البروتين ، وسوف NF-κB ربط إلى النيوبوتيدس منضما إلى البئر. وبعد ذلك تضاف الأجسام المضادة-NF-κB ، والتي ستتفاعل مع المنضم NF-κB وتنتج اشاره قياس ألوان تتناسب مع كميه NF-κB ، مما يشير إلى درجه التنشيط NF-κB. هذا الأسلوب هو مفيد علي EMSA في انه لا يتطلب الأحماض النووية الشعاعية والكمية ، في المقارنة. مهما, تحذير من هذا أسلوب ان هو ثانيه لا يميز بين [كروماتين] دول من [نف-Κب] هدف مورثات14.
طريقه أخرى التي NF-κb التنشيط قد يتم الكشف عنها بواسطة الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن (رقاقه) ، حيث الحمض النووي والبروتينات المتفاعلة هي عبر مرتبطة مع الفورمالديهايد والإيمونوبريسيبيتاتيد مع الأجسام المضادة لمكافحه nf-κb محدده. ثم يتم تنقيه شظايا النيوكليوتيد المحددة وتحديدها من خلال تضخيم PCR أو التسلسل الإنتاجي العالي المباشر. وتوفر النتائج المتولدة من هذه الطريقة نتائج شبه كميه للنشاط الملزم NF-κB مع الجينات المستهدفة. ومع ذلك ، فان النتائج تعتمد بشكل كبير علي شروط التثبيت وعمليات التنقية في كل خطوه15.
في اختبارات نقل المواقع النووية ، يتم تحفيز الخلايا للحث علي تنشيط NF-κB ومن ثم إصلاحها. يتم أضافه الأجسام المضادة لp65 إلى الخلايا الثابتة. وبدلا من ذلك ، يمكن وضع علامة علي الوحدة الفرعية p65 نفسها باستخدام ببتيد فلوري مثل الأخضر الفلوري الأخضر (GFP). في كلتا الحالتين ، سيسمح المناعي التصوير من توطين p65 لتحديد توزيع الخلوية. من خلال قياس نسبه البروتين الموضعي الخلوي والنووي ، يمكن للمحققين تحديد حاله التنشيط النسبية NF-κB. والعيب في هذا الأسلوب هو ان المناعي هو مضيعه للوقت نسبيا ، ويتطلب الأجسام المضادة مكلفه ، ويحتاج إلى خبره تقنيه أكبر نسبيا16.
ويشيع استخدام الجينات مراسل أدوات لدراسة الأنماط التنظيمية والتعبير من جين الفائدة. عاده ، يتم بناء الجينات مراسل من تسلسل المروج لجين الفائدة تنصهر إلى الترميز الجينات لبروتين قابل للكشف بسهوله. يتم اختيار البروتينات مع الانشطه الانزيميه ، فلوري ، أو خصائص التلالؤ عاده لقدرتها علي ان تكون التهاوي والكمية. وهكذا ، فان القراءة (علي سبيل المثال ، التلالؤ ، الفلورية) بمثابه اشاره للكشف عن التعبير الجيني. ويمكن بعد ذلك إدخال هذه الثوابت الصحفية في أنواع مختلفه من الخلايا ، مثل الخلايا الظهاريه أو الضامة.
الموصوفة في البروتوكول هو استخدام خط الخلية هيلا المستنسخة (هيلا 57a) التي يتم نقلها بشكل ثابت مع مراسل لوسيفيراز تحتوي علي ثلاث نسخ من توافق الآراء κb من κ الغلوبولين المناعي المنطقة17المروج. التعبير عن لوسيفيراز يعتمد علي تنشيط NF-κb ، الذي يحدث بعد تحفيز الخلايا. الخلايا المحفزة بسهوله باستخدام الخلية تحلل العازلة المقدمة في مجموعه الفحص لوسيفيراز. ثم يتم خلط جزء من محلله الخلية مع العازلة الفحص لوسيفيراز الذي يحتوي علي لوسيفيراز. Luciferin هو الركيزة من luciferin ومطلوب لتوليد الضوء في وجود luciferin. بعد الجمع بين العازلة الفحص مع lysate ، فان الحل تنبعث الضوء في عمليه تعرف باسم التلالؤ. كميه الضوء المنتجة ، نظرا في شمعه ، يتناسب مع كميه لوسيفيراز الموجودة في محلله وبمثابه مقياس للتنشيط NF-κb. وتفسر قراءات التجويف بالمقارنة مع معيار غير محفز لحساب النشاط NF-κB خط الأساس والاشاره نفسها مستقره لعده دقائق للسماح لقياس موثوق بها. الاضافه إلى ذلك ، يتم نقل خط الخلية هيلا 57A بشكل ثابت مع مراسل غالاكتوزيداز المستقلة NF-κB. المراسلة [β-غالاكتوزيداز عبر عن دستوريا, و [β-غالاكتوزيداز] نشاط يستطيع كنت قست إلى تحكم لخليه بقاء أو تغير في خليه أرقام17. ويمكن بعد ذلك تعديل قيم لوسيفيراز إلى قيم β-غالاكتوزيداز والإبلاغ عنها كزيادة اضعاف علي خلايا التحكم غير المحفزة.
منذ NF-κB هو عامل النسخ المسؤولة عن زيادة التعبير عن الجينات الهدف NF-κB المعتمدة ، ومتابعه التجربة للسيطرة علي NF-κB-تعتمد زيادة التعبير الجينات هو النسخ العكسي العددية تفاعل البلمره سلسله ( RT-qPCR). ان RT-qPCR هي طريقه حساسة للغاية يمكن من خلالها قياس التغيرات في التعبير الجيني علي عده أوامر بالحجم. يتم حصاد الخلايا المحفزة والمسيطرة للجيش النيبالي الريبي عبر استخراج كلوروفورم الفينول. بعد فصل مرحله, استخرجت [رنا] كالعنصر رئيسيه من الطبقة مائية. ثم عجلت RNA وغسلها لإنتاج بيليه نقيه. ثم يتم أعاده تشكيل هذا بيليه وتنظيفها من الحمض النووي الملوث عن طريق العلاج DNase. ثم يتم عكس الحمض النووي الريبي النقي لإنشاء DNA التكميلي (cDNA). ويمكن بعد ذلك تحليل هذه التقنية من خلال تقنيات PCR الكمية ، حيث يتم قياس وفره تسلسل mRNA محدده لتحديد التعبير الجيني. لا توضح هذه التقنية التحكم الانتقالي ، أو التعديل بعد الانتقالية ، أو وفره البروتين ، أو نشاط البروتين. ومع ذلك ، يتم تنظيم العديد من الجينات ، ولا سيما تلك التي تشارك في العمليات الموالية للالتهابات ، عن طريق NF-κB ووفرتها mRNA يدل علي التعبير عنها.
الطريقة المقترحة هنا يستخدم طريقه سريعة وبسيطه التي NF-κB التنشيط يمكن الكشف عنها عن طريق اختبارات التلالؤ من lysate الخلوية. ويمكن استخدام RT-qPCR من NF-κB الهدف التعبير الجيني لقياس التعبير عن جينات معينه ، فضلا عن التحقق من صحة النشاط الوظيفي NF-κB التنشيط. المزايا الرئيسية لمثل هذا النظام هي بساطته والسرعة ، والذي يسمح لفحص الانتاجيه العالية من مجموعه من الشروط التي تعدل NF-κB التنشيط. هذا البروتوكول هو مناسبه لخطوط الخلايا الأخرى التعبير عن NF-κB:: المراسل luciferase ، وقد ثبت في الخلايا 264.7 الخام المتحولة بشكل ثابت18. مقدار الوقت اللازم للتعامل مع العينات ، بدءا من تحلل الخلية لتوليد اشاره التلالؤ ، هو الحد الأدنى وياخذ فتره حوالي ساعة. قياس NF-κB يتطلب فقط المعدات المختبرية الاساسيه مثل لوحات مبهمه ، قارئ لوحه قادره علي قياس التلالؤ ، والبرمجيات تحليل البيانات البسيطة مثل برنامج جدول بيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
المساهمة الرئيسية للبروتوكول الموصوفة هي انه يوفر طريقه سريعة وسهله للكشف عن التنشيط NF-κB في الخلايا ، والذي يسمح لتحليل الانتاجيه العالية من الظروف تنشيطية متعددة أو الادويه التي تؤثر علي تنشيط NF-κB. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتنشيط NF-κB في الخلايا هيلا المصابة السالمونيلا. ويمكن استخد?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم البحوث في مختبر كيسترا-غندر بمنح من NIAID من المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21AI122092 ومن جمعيه السكري الامريكيه تحت جائزه رقم 1-18-JDF-035.
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
Riferimenti
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
