NF-κB-afhankelijke Luciferase activering en kwantificering van genexpressie in met salmonella geïnfecteerde weefselkweek cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol om snel en gemakkelijk te meten nucleaire factor Kappa-Light-Chain-Enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB) activering in cellijnen die NF-κB:: Luciferase reporter constructies, via metingen van luminescentie in de cel lysaat. Bovendien wordt genexpressie bepaald via RT-qPCR geïsoleerd uit cellen die besmet zijn met salmonella typhimurium.

Abstract

De dimeer transcriptiefactor NF-κb regelt veel cellulaire respons trajecten, waaronder ontstekings trajecten door het induceren van de expressie van verschillende cytokinen en chemokines. NF-κB is grondwettelijk uitgedrukt en wordt in de cytosol door de remmende proteïne-nucleaire factor van Kappa Light polypeptide Gene Enhancer in B-cellen remmer, Alfa (IκBα) gesequereerd. Activering van NF-κB vereist de afbraak van IκBα, die vervolgens een nucleair lokalisatie signaal op NF-κB blootstelt en zijn handel in de Nucleus bevordert. Eenmaal in de Nucleus bindt NF-κB aan de promotor regio van NF-κB doel genen zoals Interleukine 6 (IL-6) en IL-23, om hun expressie te promoten.

De activering van NF-κB vindt plaats onafhankelijk van transcriptie of vertaling. Daarom moet de activeringsstatus van NF-κB worden gemeten door de NF-κB specifiek in de Nucleus te kwantificeren, of door de expressie van NF-κB-doel genen te kwantificeren. In dit protocol worden cellen stabiel met een NF-κB:: Luciferase reporter construct geassageerd voor NF-κB-activering met behulp van in vitro weefselkweek technieken. Deze cellen zijn geïnfecteerd met salmonella typhimurium om NF-κb te activeren, die naar de Nucleus tradt en zich bindt aan de κb-sites in de Promoter regio van Luciferase, waardoor de uitdrukking ervan wordt induceren. Cellen zijn gelyseerd en geanalyseerd met het plaats-testsysteem. De hoeveelheid plaats geproduceerd door de cellen correleert met de intensiteit van het luminescentie signaal, die wordt gedetecteerd door een plaat lezer. Het luminescentie signaal dat door deze procedure wordt gegenereerd, biedt een snelle en zeer gevoelige methode om de activering van NF-κB onder een reeks voorwaarden te beoordelen. Dit protocol maakt ook gebruik van kwantitatieve reverse transcriptie PCR (RT-qPCR) om relatieve mRNA-niveaus te detecteren die indicatief zijn voor genexpressie.

Introduction

De nucleaire factor-κB (NF-κB) familie van eiwitten zijn belangrijke transcriptie Activators die de genexpressie in verschillende biologische trajecten reguleren. Activering van NF-κb induceert transcriptie van doel genen, waarvan vele belangrijk zijn voor immuun-en ontstekingsreacties, celproliferatie, stress reacties en progressie van kanker^1,2. NF-κB speelt een integrale rol in het bemedieren van vroege inflammatoire uitkomsten voor pathogeen klaring. Gezien de vele biologische processen bemiddeld door NF-κB activering, verstoringen in de signalering kunnen ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid en ziekte. Verlies van functie mutaties in NF-κB-signalering zijn geassocieerd met verschillende immuundeficiëntie fenotypes, terwijl de winst van functie mutaties gepaard gaat met verschillende soorten kankers, waaronder B-cell lymfoomen en borstkanker³. Bovendien is gebleken dat veel pathogenen de activeringsstatus van NF-κb direct moduleren door expressie van virulentie factoren^4,5,6,7.

Activering van NF-κB is bekend als een gevolg van vele variabele stimuli, waaronder bacteriële producten zoals lipopolysacchariden (LPS), flagellin en peptidoglycans bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs). Deze PAMPs worden gedetecteerd door patroonherkenning receptoren (PRRs) zoals de tolplichtige receptoren (TLRs) en NOD-achtige receptoren (NLRs) leidt tot de activering van NF-κB en de daaropvolgende uitdrukking van een array van NF-κB-afhankelijke inflammatoire genen⁸. Naast PRR activering door PAMPs, andere bacteriële producten, zoals bacteriële Effector eiwitten, kan de activering van NF-κB induceren. Interessant, bacteriën ook uitdrukken Effector eiwitten die actief het NF-κB-traject te verzachten en hun pathogeniteit te verbeteren, onderstrepen het belang van NF-κB als een essentiële bemiddelaar van immuniteit⁹.

Er zijn vijf verschillende subeenheden die de NF-κB dimers vormen; P50, P52, RelA (p65), RelB en cRel. De twee belangrijkste NF-κB heterodimers zijn de P50: RelA en de P52: RelB dimers. De geactiveerde NF-κb Dimeren binden aan DNA-sites, bekend als κb-sites, in de organisator en versterker regio’s van verschillende doel genen. Onder normale homeostatische omstandigheden communiceert NF-κB met een familie van remmer-eiwitten die bekend staan als IκB-eiwitten om inactief te blijven. Bij stimulatie wordt IκB gefosforyleerd door IκB kinase (IKK), waardoor het doelwit kan worden van alomtegenwoordige installaties en vervolgens afbraak. Afbraak van IκB activeert NF-κB door een nucleair lokalisatie signaal te onthullen. NF-κB gaat vervolgens naar de Nucleus, waar het κB-sites bindt in de Promoter regio van doel genen en transcriptie¹⁰bevordert. Dus, activering van NF-κB upregulates mRNA expressie van NF-κB doel genen, en deze verandering kan worden gemeten door middel van RNA kwantificerings testen zoals RT-qPCR¹¹.

Er bestaan verschillende methoden en worden vaak gebruikt voor de meting van NF-κB-activering, waaronder elektroforetisch mobiliteits verschuiving-assays (EMSA), nucleaire translocatie en genreporter-assays. EMSA wordt gebruikt om eiwitcomplexen met nucleïnezuren op te sporen. De gestimuleerde cellen worden gefractioneerd om nucleaire eiwitten te isoleren, waaronder de translocatie NF-κb, die vervolgens wordt geïntrigeerd met van-nucleotiden die het NF-κb-bindings domein bevatten. De monsters worden uitgevoerd op een gel en afbeelding gemaakt door autoradiografie van ³²P-gelabelde nucleïnezuur. Als NF-κB aanwezig is in de eiwitfractie, zal het de nucleotiden binden, die langzamer door de gel zullen migreren en als discrete bands presenteren. Kern fracties van cellen die niet zijn geactiveerd NF-κB (bijv. ongestimuleerde controle cellen) produceren geen banden als de nucleotiden sneller migreren naar het einde van de gel. Een groot nadeel van deze methode is dat het grotendeels kwantitatief is in de binaire zin (d.w.z., aan of uit) en onvoldoende zinvolle verschillen vastlegt in de NF-κB-bindingscapaciteit. Bovendien beschouwt deze methode geen chromatine structuren die functioneel belangrijk zijn voor NF-κb doel genen^12,13.

Net als bij de vorige methode is er een “non-Shift”-test waarbij multi-well-platen zijn bekleed met nucleotiden die de NF-κB-bindingsvolgorde bevatten. Na behandeling van cellen met kern fracties van eiwitten, zal NF-κB binden aan de nucleotiden gebonden aan de put. Anti-NF-κB antilichamen worden vervolgens toegevoegd, die zal interageren met de gebonden NF-κB en produceren een colorimetrische signaal evenredig aan de hoeveelheid NF-κB, met vermelding van de mate van NF-κB activering. Deze methode is gunstig ten opzichte van het EMSA, omdat het geen radiofiele nucleïnezuren vereist en in vergelijking daarmee kwantitatief is. Echter, een nadeel van deze methode is dat het opnieuw geen onderscheid maakt tussen chromatine toestanden van NF-κB doel genen¹⁴.

Een andere methode waarmee NF-κB-activering kan worden gedetecteerd, is door Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), waarbij DNA en interactie eiwitten kruislings worden gekoppeld met formaldehyde en immunoprecipitated met specifieke anti-NF-κB-antilichamen. De specifieke nucleotide-fragmenten worden vervolgens gezuiverd en geïdentificeerd door middel van PCR-versterking of directe hoge doorvoer volgorde. Resultaten gegenereerd op basis van deze methode bieden semi-kwantitatieve resultaten van NF-κB bindende activiteit met doel genen. De resultaten zijn echter sterk afhankelijk van de fixatie condities en zuiveringsprocessen bij elke stap¹⁵.

In nucleaire translocatie testen, cellen worden gestimuleerd voor het opwekken van NF-κB activering en vervolgens vast. Anti-p65 antilichamen worden toegevoegd aan vaste cellen. Als alternatief kan de p65-subeenheid zelf worden getagd met een fluorescerende peptide zoals Green Fluorescent Green (GFP). In beide gevallen zal immunofluorescentie Imaging van de lokalisatie van p65 toestaan om de cellulaire distributie te bepalen. Door het meten van het aandeel cytosolische en nucleaire gelokaliseerde eiwitten kunnen onderzoekers de relatieve activeringsstatus van NF-κB bepalen. Een nadeel van deze methode is dat de immunofluorescentie relatief tijdrovend is, dure antilichamen vereist en een relatief grotere technische expertise nodig heeft¹⁶.

Reporter genen zijn veelgebruikte tools om de regulatoire en expressie patronen van een gen van belang te bestuderen. Typisch, reporter genen zijn opgebouwd uit de organisator sequentie van een gen van belang gesmolten tot een gen coderen voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit. Eiwitten met enzymatische activiteiten, fluorescentie of luminescentie eigenschappen worden vaak gekozen voor hun vermogen om te worden getest en gekwantificeerd. Zo dient de read-out (bijvoorbeeld luminescentie, fluorescentie) als een signaal voor de detectie van de genexpressie. Deze reporter constructies kunnen vervolgens worden geïntroduceerd in verschillende celtypen, zoals epitheelcellen of macrofagen.

Beschreven in het protocol is het gebruik van een gekloonde Hela-cellijn (Hela 57a) die stabiel is getransfeerd met een plaats-reporter met drie kopieën van de κb-consensus van de immunoglobuline κ-Chain Promoter Region¹⁷. Expressie van plaats is afhankelijk van de activering van NF-κb, die optreedt na celstimulatie. Gestimuleerd cellen zijn gemakkelijk gelyseerd met behulp van cellysisbuffer in de plaats-assay kit. Een deel van de cel lysaat wordt vervolgens gemengd met plaats assay buffer die luciferin bevat. Luciferin is het substraat van plaats en is vereist voor het opwekken van licht in de aanwezigheid van plaats. Na het combineren van de assay buffer met het lysaat, zal de oplossing licht uitstralen in een proces dat bekend staat als luminescentie. De hoeveelheid licht geproduceerd, gegeven in lumen, is evenredig aan de hoeveelheid plaats aanwezig zijn in het lysaat en dient als een maatstaf van NF-κb activering. De lumen metingen worden geïnterpreteerd in vergelijking met een niet-gestimuleerde standaard om rekening te houden met de baseline NF-κB-activiteit en het signaal zelf is gedurende enkele minuten stabiel om een betrouwbare meting mogelijk te maken. Daarnaast is de HeLa 57A cellijn stabiel getransfunteerd met een NF-κB-onafhankelijke β-galactosidase Reporter. De β-galactosidase Reporter wordt grondwettelijk uitgedrukt en β-galactosidase-activiteit kan worden gemeten om de levensvatbaarheid van de cel of de variatie in celaantallen¹⁷te controleren. De plaats-waarden kunnen vervolgens worden aangepast aan de β-galactosidase-waarden en worden gerapporteerd als vouw verhoging over de niet-gestimuleerde controle cellen.

Aangezien NF-κB een transcriptiefactor is die verantwoordelijk is voor de toegenomen expressie van NF-κB-afhankelijke doel genen, is een follow-up experiment om te controleren op NF-κB-afhankelijke verhoogde genexpressie een kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie ( RT-qPCR). RT-qPCR is een zeer gevoelige methode waarmee veranderingen in de genexpressie kunnen worden gekwantificeerd over verschillende ordes van grootte. Gestimuleerd en controle cellen worden geoogst voor RNA via fenol-chloroform extractie. Na fasescheiding wordt RNA geëxtraheerd als de belangrijkste component van de waterige laag. RNA wordt vervolgens neergeprecipiteerd en gewassen om een zuivere pellet te produceren. Deze pellet wordt vervolgens gereconstitueerd en verder gereinigd van verontreiniging DNA via DNase behandeling. Het zuivere RNA wordt dan omgekeerd getranscribeerd om aanvullend DNA (cDNA) te creëren. Deze cDNA kan vervolgens worden geanalyseerd via kwantitatieve PCR-technieken, waarbij de overvloed van een specifieke mRNA-sequentie wordt gekwantificeerd om de genexpressie te bepalen. Deze techniek geeft geen duidelijkheid over translationele controle, post translationele modificatie, eiwit overvloed of eiwit activiteit. Echter, veel genen, met name degenen die betrokken zijn bij pro-inflammatoire processen, worden gereguleerd via NF-κB en hun mRNA overvloed is indicatief voor hun uitdrukking.

De voorgestelde methode maakt gebruik van een snelle en eenvoudige manier waarop NF-κB activering kan worden gedetecteerd via luminescentie assays van cellulair lysaat. RT-qPCR van NF-κB target genexpressie kan worden gebruikt om de expressie van bepaalde genen te kwantificeren en om functionele activiteit van NF-κB-activering te valideren. De grote voordelen van een dergelijk systeem zijn de eenvoud en snelheid, die zorgt voor een hoge doorvoer screening van een scala aan voorwaarden die NF-κB activering moduleren. Dit protocol is geschikt voor andere cellijnen die een NF-κB:: Luciferase Reporter, en is aangetoond in stabiel getransformuteerd RAW 264.7 Cells¹⁸. De hoeveelheid tijd die nodig is om monsters te verwerken, beginnend met cellysis om een luminescentie signaal te genereren, is minimaal en duurt ongeveer een uur. Meting van NF-κB vereist alleen basis laboratoriumapparatuur zoals ondoorzichtige platen, een plaat lezer die luminescentie kan meten en eenvoudige gegevensanalyse software zoals een spreadsheetprogramma.

Protocol

1. celpassaging en seeding Houd HeLa 57A cellen in een kolf van 75 cm2 met 10 ml van dulbecco’s gemodificeerde eagle’s media (DMEM) aangevuld met 5% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 . Aspirate celkweek media en wassen met 1 mL 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. Aspirate trypsine en vervang met een extra 1 mL. Plaats de kolf in een incubator van 37 °C voor 4-5 min om cellen los te maken van de kolf. Voeg 9 mL celkweek me…

Representative Results

De hier beschreven bepaling richt zich op de activering van de transcriptiefactor NF-κb met behulp van een NF-κb-afhankelijke plaats-reporter die stabiel is omgezet in een lijn van HeLa-cellen. Geactiveerde NF-κB-trans lokaliseert naar de Nucleus waar de κB-bindingsplaatsen van doel genen worden gebonden, waaronder de pro-inflammatoire cytokines IL6 en IL23. Een algemeen overzicht van NF-κB-activering wordt afgebeeld in afbeelding 1. De…

Discussion

De belangrijkste bijdrage van het beschreven protocol is dat het biedt een snelle en eenvoudige methode voor het opsporen van NF-κB activering in cellen, die zorgt voor een hoge doorvoer analyse van meerdere stimulerende voorwaarden of geneesmiddelen die de NF-κB activering beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol voor de NF-κB-activering in met salmonellageïnfecteerde HeLa-cellen. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor infectie met andere pathogenen ook om te bestuderen van de impact van bacteriële …

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate