NF-B-abhängige Luziferase-Aktivierung und Quantifizierung der Genexpression in Salmonellen-infizierten Gewebekulturzellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung des Kernfaktors Kappa-Light-Chain-Enhancer der aktivierten B-Zellen(NF-B)-Aktivierung in Zelllinien vor, die NF-B::luciferase-Reporterkonstrukte über Messungen der Lumineszenz im Zelllysat exezieren. Zusätzlich wird die Genexpression über RT-qPCR bestimmt, isoliert aus Zellen, die mit Salmonella Typhimurium infiziert sind.
Abstract
Der dimerische Transkriptionsfaktor NF-B reguliert viele zelluläre Reaktionswege, einschließlich entzündungshemmender Bahnen, indem er die Expression verschiedener Zytokine und Chemokine induziert. NF-B wird konstitutiv exprimiert und im Zytosol durch den hemmenden Protein-Kernfaktor kappa light polypeptide gen enhancer in B-Zellen-Inhibitor, Alpha (I-B) sequestriert. Die Aktivierung von NF-B erfordert die Degradierung von I-B, das dann ein nukleares Lokalisierungssignal auf NF-B aussetzt und seinen Handel mit dem Kern fördert. Einmal im Kern, NF-B bindet an die promotorische Region von NF–B Zielgene wie Interleukin 6 (IL-6) und IL-23, um ihre Expression zu fördern.
Die Aktivierung von NF-B erfolgt unabhängig von Transkription oder Übersetzung. Daher muss der Aktivierungszustand von NF-B entweder durch Quantifizierung von NF-B speziell im Kern oder durch Quantifizierung der Expression von NF-B-Zielgenen gemessen werden. In diesem Protokoll werden Zellen, die mit einem NF-B::luciferase-Reporterkonstrukt stabil transfiziert wurden, für die NF-B-Aktivierung mit In-vitro-Gewebekulturtechniken untersucht. Diese Zellen sind mit Salmonella Typhimurium infiziert, um NF-B zu aktivieren, das an den Zellkern verkehrt und an die Standorte in der Promotorregion der Luziferase bindet, was seine Expression induzieren. Die Zellen werden lysiert und mit dem Luziferase-Assay-System analysiert. Die von den Zellen erzeugte Luziferasemenge korreliert mit der Intensität des Lumineszenzsignals, das von einem Plattenleser erkannt wird. Das durch dieses Verfahren erzeugte Lumineszenzsignal bietet eine schnelle und hochempfindliche Methode, um die NF-B-Aktivierung unter einer Reihe von Bedingungen zu bewerten. Dieses Protokoll verwendet auch quantitative Reverse-Transkription PCR (RT-qPCR), um relative mRNA-Spiegel zu erkennen, die auf die Genexpression hinweisen.
Introduction
Die Proteinfamilie des Kernfaktors (NF-B) ist ein wichtiger Transkriptionsaktivatoren, der die Genexpression in verschiedenen biologischen Bahnen reguliert. Die Aktivierung von NF-B induziert die Transkription von Zielgenen, von denen viele wichtig für Immun- und Entzündungsreaktionen, Zellproliferation, Stressreaktionen und Krebsprogression1,2sind. NF-B spielt eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung von frühen entzündlichen Ergebnissen für die Errekung von Krankheitserregern. Angesichts der vielen biologischen Prozesse, die durch die NF-B-Aktivierung vermittelt werden, können Störungen in ihrer Signalisierung schwerwiegende Folgen für Gesundheit und Krankheit haben. Der Verlust von Funktionsmutationen in der NF-B-Signalisierung ist in mehreren Immunschwäche-Phänotypen verbunden, während die Verstärkung von Funktionsmutationen mit verschiedenen Krebsarten verbunden ist, einschließlich B-Zell-Lymphomen und Brustkrebs3. Darüber hinaus haben viele Krankheitserreger gezeigt, dass sie den Aktivierungszustand von NF-B direkt durch Expression von Virulenzfaktoren4,5,6,7modulieren.
Die Aktivierung von NF-B ist bekanntlich eine Folge vieler variabler Reize, einschließlich bakterieller Produkte wie Lipopolysaccharide (LPS), Flagellin und Peptidoglykanen, die als pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) bekannt sind. Diese PAMPs werden von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie den Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und Nod-like Receptors (NLRs) detektiert, was zur Aktivierung von NF-B und der anschließenden Expression einer Reihe von NF-B-abhängigen Genen führt, die entzündlich8. Zusätzlich zur PRR-Aktivierung durch PAMPs können andere bakterielle Produkte, wie bakterielle Effektorproteine, die Aktivierung von NF-B induzieren. Interessanterweise drücken Bakterien auch Effektorproteine aus, die den NF-B-Signalweg aktiv dämpfen und ihre Pathogenität verbessern, was die Bedeutung von NF-B als wesentlicher Vermittler der Immunität9unterstreicht.
Es gibt fünf verschiedene Untereinheiten, die die NF-B-Dimere bilden; p50, p52, RelA (p65), RelB und cRel. Die beiden Haupt-NF-B-Heterodimere sind die p50:RelA- und die p52:RelB-Dimere. Die aktivierten NF-B-Dimere binden an DNA-Sites, sogenannte B-Sites, in den Promotor- und Enhancer-Regionen verschiedener Zielgene. Unter normalen panostatischen Bedingungen interagiert NF-B mit einer Familie von Inhibitorproteinen, die als I-B-Proteine bekannt sind, um inaktiv zu bleiben. Bei der Stimulation wird I-B durch die I-B-Kinase (IKK) phosphoryliert, wodurch es möglich ist, sie für die Ubiquitination und anschließende Degradation gezielt zu machen. Die Degradation von I-B aktiviert NF-B, indem ein nukleares Lokalisierungssignal aufgedeckt wird. NF-B transloziert dann in den Kern, wo es die Standorte in der Promotorregion der Zielgene bindet und die Transkription10fördert. So reguliert die Aktivierung von NF-B die mRNA-Expression von NF-B-Zielgenen, und diese Veränderung kann durch RNA-Quantifizierungstests wie RT-qPCR11gemessen werden.
Es gibt mehrere Methoden, die häufig für die Messung der NF-B-Aktivierung verwendet werden, einschließlich elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), Nukleartranslokation und Genreporter-Assays. EMSA wird verwendet, um Proteinkomplexe mit Nukleinsäuren zu erkennen. Stimulierte Zellen werden fraktioniert, um Kernproteine zu isolieren, einschließlich der translozierten NF-B, die dann mit radioaktiv markierten Nukleotiden inkubiert wird, die die NF-B-Bindungsdomäne enthalten. Die Proben werden auf einem Gel ausgeführt und durch Autoradiographie von 32P-markierter Nukleinsäure abgebildet. Wenn NF-B in der Proteinfraktion vorhanden ist, bindet es die Nukleotide, die langsamer durch das Gel wandern und als diskrete Bänder präsentieren. Kernfraktionen von Zellen ohne aktivierte NF-B (z. B. unstimulierte Kontrollzellen) erzeugen keine Bänder, da die Nukleotide schneller bis zum Ende des Gels wandern. Ein großer Nachteil dieser Methode ist, dass sie weitgehend quantitativ im binären Sinne (d. h. ein- oder ausgeschaltet) ist und keine signifikanten Unterschiede in der NF-B-Bindungskapazität ausreichend erfasst. Darüber hinaus berücksichtigt diese Methode keine Chromatinstrukturen, die für NF-B-Zielgene12,13funktionell wichtig sind.
Ähnlich wie bei der vorherigen Methode gibt es einen “Nicht-Shift”-Assay, bei dem Multiwell-Platten mit Nukleotiden beschichtet sind, die die NF-B-Bindungssequenz enthalten. Nach der Behandlung von Zellen mit kernnuklearen Proteinfraktionen bindet NF-B an die an den Brunnen gebundenen Nukleotide. Anschließend werden Anti-NF–B-Antikörper hinzugefügt, die mit dem gebundenen NF-B interagieren und ein kolorimetrisches Signal erzeugen, das proportional zur NF-B-Menge ist, was den Grad der NF-B-Aktivierung angibt. Dieses Verfahren ist gegenüber der EMSA insofern vorteilhaft, als es keine radioaktiv markierten Nukleinsäuren benötigt und im Vergleich quantitativ ist. Ein Vorbehalt dieser Methode ist jedoch, dass sie wiederum nicht zwischen Chromatinzuständen von NF-B-Zielgenen14unterscheidet.
Eine weitere Methode, bei der die NF-B-Aktivierung nachgewiesen werden kann, ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), bei der DNA und interagierende Proteine mit Formaldehyd vernetzt und mit spezifischen Anti-NF-B-Antikörpern immunpräzipiert werden. Die spezifischen Nukleotidfragmente werden dann gereinigt und durch PCR-Verstärkung oder direkte Sequenzierung mit hohem Durchsatz identifiziert. Die ergebnissedieser Methode liefern semiquantitative Ergebnisse der NF-B-Bindungsaktivität mit Zielgenen. Die Ergebnisse sind jedoch in hohem Maße von den Fixierungsbedingungen und Reinigungsprozessen bei jedem Schritt15abhängig.
In nuklearen Translokationstests werden Zellen stimuliert, um die NF-B-Aktivierung zu induzieren, und dann fixiert. Anti-p65-Antikörper werden festen Zellen zugesetzt. Alternativ kann die unterkundliche Einheit p65 selbst mit einem fluoreszierenden Peptid wie grünem Fluoreszenzgrün (GFP) markiert werden. In beiden Fällen ermöglicht die Immunfluoreszenz die Abbildung der Lokalisation von p65, um die Zellverteilung zu bestimmen. Durch die Messung des Anteils des zytosolischen und nuklearen lokalisierten Proteins können die Forscher den relativen Aktivierungszustand von NF-B bestimmen. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Immunfluoreszenz vergleichsweise zeitaufwändig ist, teure Antikörper erfordert und relativ mehr technisches Know-how benötigt16.
Reportergene sind häufig verwendete Werkzeuge, um die Regulierungs- und Expressionsmuster eines Gens von Interesse zu untersuchen. Typischerweise werden Reportergene aus der Promotorsequenz eines Gens von Interesse konstruiert, das zu einem Gen verschmolzen wird, das für ein leicht nachweisbares Protein kodiert. Proteine mit enzymatischen Aktivitäten, Fluoreszenz- oder Lumineszenzeigenschaften werden häufig aufgrund ihrer Fähigkeit, untersucht und quantifiziert zu werden, ausgewählt. Somit dient das Auslesen (z.B. Lumineszenz, Fluoreszenz) als Signal zum Nachweis der Genexpression. Diese Reporterkonstrukte können dann in verschiedene Zelltypen eingeführt werden, z. B. Epithelzellen oder Makrophagen.
Beschrieben im Protokoll ist die Verwendung einer geklonten HeLa-Zelllinie (HeLa 57A), die mit einem Luziferase-Reporter, der drei Kopien des C-Konsens der Immunglobulin-Kette-Promotorregion enthält, stabil transfiziert wird17. Die Expression der Luziferase ist abhängig von der Aktivierung von NF-B, die nach der Zellstimulation erfolgt. Stimulierte Zellen lassen sich leicht mit dem Zelllysepuffer lysiert, der im Luziferase-Assay-Kit bereitgestellt wird. Ein Teil des Zelllysats wird dann mit luziferase Assay Puffer gemischt, die Luziferin enthält. Luziferin ist das Substrat der Luziferase und wird für die Erzeugung von Licht in Gegenwart von Luziferase erforderlich. Nach der Kombination des Assaypuffers mit dem Lysat wird die Lösung Licht in einem Prozess aussenden, der als Lumineszenz bekannt ist. Die in Lumen angegebene Lichtmenge ist proportional zur im Lysat vorhandenen Luziferasemenge und dient als Maß für die NF-B-Aktivierung. Die Lumenwerte werden im Vergleich zu einem nicht stimulierten Standard interpretiert, um die Basisaktivität von NF-B zu berücksichtigen, und das Signal selbst ist für mehrere Minuten stabil, um eine zuverlässige Messung zu ermöglichen. Darüber hinaus wird die HeLa 57A-Zelllinie stabil mit einem NF–unabhängigen -galactosidase-Reporter transfiziert. Der Reporter von ‘-galactosidase wird konstitutiv ausgedrückt, und die Aktivität von ‘galactosidase kann gemessen werden, um die Zelllebensfähigkeit oder Variation der Zellzahlen17zu kontrollieren. Die Luziferase-Werte können dann an die Werte von ‘-galactosidase angepasst und als Faltenanstieg über die unstimulierten Kontrollzellen gemeldet werden.
Da NF-B ein Transkriptionsfaktor ist, der für die erhöhte Expression von NF-B-abhängigen Zielgenen verantwortlich ist, ist ein Folgeexperiment zur Kontrolle der NF-B-abhängigen erhöhten Genexpression die quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion ( RT-qPCR). RT-qPCR ist eine hochempfindliche Methode, mit der Veränderungen in der Genexpression über mehrere Größenordnungen quantifiziert werden können. Stimulierte und Kontrollzellen werden für RNA über die Phenol-Chlor-Extraktion geerntet. Nach der Phasentrennung wird RNA als Hauptbestandteil der wässrigen Schicht extrahiert. DIE RNA wird dann ausgefällt und gewaschen, um ein reines Pellet zu produzieren. Dieses Pellet wird dann rekonstituiert und durch DNase-Behandlung weiter von der Schadstoff-DNA gereinigt. Die reine RNA wird dann umgekehrt transkribiert, um komplementäre DNA (cDNA) zu erzeugen. Diese cDNA kann dann durch quantitative PCR-Techniken analysiert werden, bei denen die Häufigkeit einer bestimmten mRNA-Sequenz quantifiziert wird, um die Genexpression zu bestimmen. Diese Technik erhellt keine translationale Kontrolle, posttranslationale Modifikation, Proteinüberfluss oder Proteinaktivität. Viele Gene, insbesondere solche, die an entzündungshemmenden Prozessen beteiligt sind, werden jedoch über NF-B reguliert und ihre mRNA-Fülle ist bezeichnend für ihre Expression.
Die hier vorgeschlagene Methode nutzt eine schnelle und einfache Möglichkeit, mit der die NF-B-Aktivierung über Lumineszenz-Assays von zellulärem Lysat erkannt werden kann. RT-qPCR der NF-B-Zielgenexpression kann verwendet werden, um die Expression bestimmter Gene zu quantifizieren und die funktionelle Aktivität der NF-B-Aktivierung zu validieren. Die Hauptvorteile eines solchen Systems sind seine Einfachheit und Geschwindigkeit, die für eine hohe Durchsatz-Screening einer Reihe von Bedingungen ermöglicht, die NF-B-Aktivierung modulieren. Dieses Protokoll eignet sich für andere Zelllinien, die einen NF-B::luciferase-Reporter exdrücken, und wurde in stabil transfizierten RAW264.7-Zellen18nachgewiesen. Die Zeit, die für die Handhabung von Proben benötigt wird, angefangen bei der Zelllyse bis zur Erzeugung eines Lumineszenzsignals, ist minimal und dauert etwa eine Stunde. Die Messung von NF-B erfordert nur grundlegende Laborgeräte wie undurchsichtige Platten, einen Plattenleser, der in der Lage ist, Lumineszenz zu messen, und einfache Datenanalysesoftware wie ein Tabellenkalkulationsprogramm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Beitrag des beschriebenen Protokolls ist, dass es eine schnelle und einfache Methode bietet, um die NF-B-Aktivierung in Zellen zu erkennen, was eine Analyse mehrerer Stimulierender oder Medikamente mit hohem Durchsatz ermöglicht, die die NF-B-Aktivierung beeinflussen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur NF-B-Aktivierung in Salmonellen-infiziertenHeLa-Zellen. Diese Zellen können für Infektionen mit anderen Krankheitserregern sowie verwendet werden, um die Auswirkungen der bakteriellen Infekti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung im Keestra-Gounder-Labor wird durch Stipendien des NIAID des NIH unter der Award-Nummer R21AI122092 und der American Diabetes Association unter der Award-Nummer 1-18-JDF-035 unterstützt.
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
Riferimenti
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
