Attivazione e quantificazione dell'espressione genica infette da NF-B nelle cellule di coltura dei tessuti infetti

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per misurare rapidamente e facilmente il fattore nucleare kappa-luce-catena-potenziatore delle cellule B attivate (NF-B) attivazione in linee cellulari che esprimono NF-B::luciferate reporter costruisce, attraverso misurazioni di luminescenza nel lisato di cella. Inoltre, l’espressione genica viene determinata tramite RT-qPCR isolata da cellule infettate da Salmonella Typhimurium.

Abstract

Il fattore di trascrizione dimerico NF-B regola molte vie di risposta cellulare, comprese le vie infiammatorie inducendo l’espressione di varie citochine e chemiochine. La NF-B è espressa in modo conforme ed è sequestrata nel citosol dal fattore nucleare della proteina inibitoria del potenziatore del gene del polipeptide a luce kappa nell’inibitore delle cellule B, alfa (IB). L’attivazione di NF-B richiede la degradazione di I’B, che espone poi un segnale di localizzazione nucleare su NF-B e promuove il suo traffico al nucleo. Una volta nel nucleo, NF-B si lega alla regione promotore dei geni bersaglio NF-B come l’interleumina 6 (IL-6) e l’IL-23, per promuoverne l’espressione.

L’attivazione di NF-B si verifica indipendentemente dalla trascrizione o dalla traduzione. Pertanto, lo stato di attivazione di NF-B deve essere misurato quantificando nF-B in modo specifico nel nucleo, sia quantificando l’espressione dei geni bersaglio NF-B. In questo protocollo, le cellule trattate stabilmente con un costrutto reporter NF-B::luciferate vengono analisi per l’attivazione di NF-B utilizzando tecniche di coltura dei tessuti in vitro. Queste cellule sono infettate da Salmonella Typhimurium per attivare NF-B, che traffica verso il nucleo e si lega a siti bB nella regione promotrice di luciferasi, inducendone l’espressione. Le cellule vengono lisci e analizzate con il sistema di analisi luciferasi. La quantità di luciferasi prodotta dalle cellule è correlata all’intensità del segnale di luminescenza, che viene rilevato da un lettore di piastre. Il segnale di luminescenza generato da questa procedura fornisce un metodo rapido e altamente sensibile mediante il quale valutare l’attivazione di NF-B in una serie di condizioni. Questo protocollo utilizza anche la trascrizione inversa quantitativa PCR (RT-qPCR) per rilevare i livelli relativi di mRNA che sono indicativi dell’espressione genica.

Introduction

La famiglia di proteine a fattore nucleare B (NF-B) sono importanti attivatori di trascrizione che regolano l’espressione genica in vari percorsi biologici. L’attivazione di NF-B induce la trascrizione dei geni bersaglio, molti dei quali sono importanti per le risposte immunitarie e infiammatorie, la proliferazione cellulare, le risposte allo stress e la progressione del cancro^1,2. La NF-B svolge un ruolo fondamentale nella mediazione degli esiti infiammatori precoci per la bonicccanazione degli agenti patogeni. Considerati i numerosi processi biologici mediati dall’attivazione di NF-B, le interruzioni nella segnalazione possono avere gravi conseguenze per la salute e la malattia. La perdita di mutazioni di funzione nella segnalazione di NF-B è associata in diversi fenotipi di carenza immunitaria, mentre il guadagno delle mutazioni di funzione è associato a diversi tipi di cancro, tra cui linfomi a cellule B e tumori al seno³. Inoltre, molti patogeni hanno dimostrato di modulare direttamente lo stato di attivazione di NF-B attraverso l’espressione di fattori di virulenza^4,5,6,7.

L’attivazione di NF-B è nota per essere una conseguenza di molti stimoli variabili, tra cui prodotti batterici come lipopolioaccharides (LPS), flagellina e peptidoglycans noti come modelli molecolari associati a patogeni (PUP). Questi PPR sono rilevati dai recettori di riconoscimento dei pattern (PRR), come i recettori simili a pedoni (TLR) e i recettori simili a Nod (NLR) che portano all’attivazione di NF-B e alla successiva espressione di una serie di geni infiammatori dipendenti da^{NF-B 8}. Oltre all’attivazione da parte dei PUP, altri prodotti batterici, come le proteine degli effetti batterici, possono indurre l’attivazione di NF-B. È interessante notare che i batteri esprimono anche proteine efmarcatori che attenuano attivamente il percorso NF-EB e ne migliorano la patogenicità, sottolineando l’importanza di NF-B come mediatore essenziale dell’immunità⁹.

Ci sono cinque diverse sottounità che formano i dimeri NF-B; p50, p52, RelA (p65), RelB e cRel. I due principali eterodimeri NF-B sono i dimeri p50:RelA e p52:RelB. I dimeri NF -B attivati si legano a siti di DNA, noti come siti B, nelle regioni promotrice ed potenziatore di vari geni bersaglio. In condizioni omeostatiche normali, La NF-B interagisce con una famiglia di proteine inibitori note come proteine IB per rimanere inattive. Al momento della stimolazione, ioB è fosforillato da IB Kinase (IKK), che permette di essere mirato per l’ubiquitinazione, e successivamente la degradazione. La degradazione di I’B attiva NF-B rivelando un segnale di localizzazione nucleare. La NF-B si trasferisce quindi nel nucleo, dove lega i siti B nella regione promotrice dei geni bersaglio e promuove la trascrizione¹⁰. Pertanto, l’attivazione dell’NF-B upregulatee l’espressione dell’mRNA dei geni bersaglio NF-B, e questo cambiamento può essere misurato attraverso analisi di quantificazione dell’RNA come RT-qPCR¹¹.

Esistono diversi metodi e sono comunemente utilizzati per la misurazione dell’attivazione di NF-B, tra cui i saggi elettroforici del cambio di mobilità (EMSA), la traslocazione nucleare e i saggi dei reporter genici. EMSA viene utilizzato per rilevare complessi proteici con acidi nucleici. Le cellule stimolate sono frazionate per isolare le proteine nucleari, compreso il translocare NF-B, che viene poi incubato con nucleotidi radioetichettati contenenti il dominio di legame NF-B. I campioni sono eseguiti su un gel e immagini per autoradiografia dell’acido nucleico con etichetta ³²P. Se nella frazione proteica è presente NF-B, i nucleotidi mischiano più lentamente attraverso il gel e presenti come bande discrete. Le frazioni nucleari di cellule prive di NF-B (ad esempio, cellule di controllo non stimolate) non produrranno bande in quanto i nucleotidi migrano più velocemente verso la fine del gel. Uno dei principali inconvenienti di questo metodo è che è in gran parte quantitativo in senso binario (cioè, on o off) e non cattura adeguatamente differenze significative nella capacità di associazione NF-EB. Inoltre, questo metodo non considera le strutture di cromatina che sono funzionalmente importanti per i geni bersaglio^{NF-B 12,13}.

Simile al metodo precedente, c’è un saggio “non-shift” in cui le piastre multi-bene sono rivestite con nucleotidi contenenti la sequenza di rilegatura NF-B. Dopo il trattamento delle cellule con frazioni nucleari di proteine, l’NF-B si legherà ai nucleotidi legati al pozzo. Vengono quindi aggiunti anticorpi anti-NF-B, che interagiranno con il limite NF-B e produrranno un segnale colorimetrico proporzionale alla quantità di NF-B, indicando il grado di attivazione di NF-B. Questo metodo è vantaggioso rispetto all’EMSA in quanto non richiede acidi nucleici radioetichettati ed è in confronto. Tuttavia, un’avvertenza di questo metodo è che ancora una volta non distingue tra gli stati cromatina dei geni bersaglio NF-B¹⁴.

Un altro metodo con cui può essere rilevata l’attivazione di NF-B è l’immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP), in base al quale il DNA e le proteine interagenti sono collegati tra formaldeide e sono dotati di anticorpi anti-NF-B specifici. I frammenti di nucleotide specifici vengono quindi purificati e identificati tramite amplificazione PCR o sequenziamento diretto ad alta produttività. I risultati generati da questo metodo forniscono risultati semi-quantitativi dell’attività di legame NF-B con geni bersaglio. Tuttavia, i risultati dipendono fortemente dalle condizioni di fissazione e dai processi di purificazione ad ogni passaggio¹⁵.

Nei saggi di traslocazione nucleare, le cellule vengono stimolate a indurre l’attivazione di NF-B e quindi a fissarle. Gli anticorpi anti-p65 vengono aggiunti alle cellule fisse. In alternativa, la sottounità p65 stessa può essere etichettata con un peptide fluorescente come verde fluorescente verde (GFP). In entrambi i casi, l’immunofluorescenza consentirà l’imaging della localizzazione di p65 per determinare la distribuzione cellulare. Misurando la percentuale di proteine localizzate citosoliche e nucleari, gli investigatori possono determinare lo stato di attivazione relativo di NF-B. Uno svantaggio di questo metodo è che l’immunofluorescenza richiede relativamente tempo, richiede anticorpi costosi e richiede relativamente maggiore competenza tecnica¹⁶.

I geni reporter sono strumenti comunemente usati per studiare i modelli regolatori ed espressivi di un gene di interesse. Tipicamente, i geni reporter sono costruiti dalla sequenza promotrice di un gene di interesse fuso in una codifica genica per una proteina facilmente rilevabile. Le proteine con attività enzimatiche, fluorescenza o proprietà di luminescenza sono comunemente scelte per la loro capacità di essere sapienti e quantificate. Pertanto, la lettura (ad esempio, luminescenza, fluorescenza) serve come segnale per la rilevazione dell’espressione genica. Questi costrutti reporter possono quindi essere introdotti in diversi tipi di cellule, come cellule epiteliali o macrofagi.

Descritto nel protocollo è l’uso di una linea cellulare HeLa clonata (HeLa 57A) che viene sfrattata stabilmente con un reporter luciferasi contenente tre copie del consenso di B della regione promotrice della catena immunoglobulina¹⁷. L’espressione di luciferasi dipende dall’attivazione di NF-B, che si verifica dopo la stimolazione cellulare. Le cellule stimolate sono facilmente lised utilizzando cell lysis buffer fornito nel kit di analisi luciferasi. Una parte della cella lysate viene quindi mescolata con lucidferase assay buffer che contiene luciferina. Luciferina è il substrato della luciferasi ed è necessaria per la generazione di luce in presenza di luciferasi. Dopo aver combinato il buffer di analisi con il lisato, la soluzione emetterà luce in un processo noto come luminescenza. La quantità di luce prodotta, data nei lumamen, è proporzionale alla quantità di luciferasi presente nel lisato e serve come misura dell’attivazione di NF-B. Le letture del lume vengono interpretate rispetto a uno standard non stimolato per tenere conto dell’attività di base di NF-B e il segnale stesso è stabile per diversi minuti per consentire misurazioni affidabili. Inoltre, la linea cellulare HeLa 57A è stata sfettata con un reporter NF-galactosidase indipendente da NF. Il reporter z-galactosidase è espresso in modo stitutive, e l’attività di galactosidasi può essere misurata per controllare la vitalità cellulare o la variazione nei numeri di cella¹⁷. I valori di luciferasi possono quindi essere regolati in base ai valori di galactosidasi z e segnalati come aumento di piegatura rispetto alle cellule di controllo non stimolate.

Dal momento che l’NF-B è un fattore di trascrizione responsabile della maggiore espressione dei geni bersaglio dipendenti da NF-B, un esperimento di follow-up per il controllo dell’espressione genica aumentata dipendente da NF-B è una reazione quantitativa della sequenza inversa alla catena della polimerasi ( RT-qPCR). RT-qPCR è un metodo molto sensibile con il quale i cambiamenti nell’espressione genica possono essere quantificati su diversi ordini di grandezza. Le cellule stimolate e di controllo vengono raccolte per l’RNA attraverso l’estrazione del fenolo-cloroformio. Dopo la separazione di fase, l’RNA viene estratto come componente principale dello strato acquoso. L’RNA viene quindi precipitato e lavato per produrre un pellet puro. Questo pellet viene poi ricostituito e ulteriormente pulito dal DNA contaminante attraverso il trattamento DNase. L’RNA puro viene quindi invertito trascritto per creare DNA complementare (cDNA). Questo cDNA può quindi essere analizzato attraverso tecniche di PCR quantitativa, dove l’abbondanza di una specifica sequenza di mRNA viene quantificata per determinare l’espressione genica. Questa tecnica non chiarisce il controllo traslazionale, la modifica post-traduzionale, l’abbondanza di proteine o l’attività proteica. Tuttavia, molti geni, in particolare quelli coinvolti nei processi pro-infiammatori, sono regolati tramite NF-B e la loro abbondanza di mRNA è indicativa della loro espressione.

Il metodo qui proposto utilizza un modo semplice e veloce con cui l’attivazione di NF-B può essere rilevata tramite saggi di luminescenza del lisato cellulare. Rt-qPCR dell’espressione genica bersaglio NF-B può essere utilizzato per quantificare l’espressione di particolari geni, nonché per convalidare l’attività funzionale dell’attivazione di NF-B. I principali vantaggi di un tale sistema sono la sua semplicità e velocità, che consente uno screening ad alta produttività di una serie di condizioni che modulano l’attivazione di NF-B. Questo protocollo è adatto per altre linee cellulari che esprimono un reporter NF-B::luciferase ed è stato dimostrato in celle RAW264.7 trascurabili stabilmente¹⁸. La quantità di tempo necessaria per gestire i campioni, a partire dalla lisi cellulare alla generazione di un segnale di luminescenza, è minima e richiede l’arco di circa un’ora. La misurazione di NF-B richiede solo attrezzature di laboratorio di base come piastre opache, un lettore di lastre in grado di misurare la luminescenza e un semplice software di analisi dei dati come un programma di fogli di calcolo.

Protocol

1. Passaggio cellulare e seeding Mantenere le cellule HeLa 57A in un flacone da 75 cm2 contenente 10 mL del supporto Aquila (DMEM) modificato di Dulbecco, integrato con il 5% di calore inattivato dal siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2 del 5%. Supporti di coltura cellulare aspirati e lavare con 1 mL di 0.05% soluzione trypsin-EDTA. Pioppo e sostituire con un ulteriore 1 mL. Collocare il pallone in un’incubatrice di 37 gradi centigradi per 4-5 m…

Representative Results

L’analisi qui descritta si concentra sull’attivazione del fattore di trascrizione NF-B utilizzando un giornalista lucidferasi dipendente da NF che viene scambialmente trasvenuto in una linea di cellule HeLa. Attivato NF-B trasloca nel nucleo dove lega i siti di legame B dei geni bersaglio, comprese le citochine pro-infiammatorie IL6 e IL23. Una panoramica generale dell’attivazione di NF-B è illustrata nella figura 1. Il batterio gram-negati…

Discussion

Il principale contributo del protocollo descritto è che fornisce un metodo semplice e veloce per rilevare l’attivazione di NF-B nelle cellule, che consente un’analisi ad alta produttività di più condizioni di stimolazione o farmaci che influiscono sull’attivazione di NF-B. In questo caso, descriviamo un protocollo per l’attivazione di NF-B nelle cellule HeLa infettate da Salmonella. Queste cellule possono essere utilizzate per l’infezione da altri patogeni, nonché per studiare l’impatto dell’infezione batter…

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate