NF-κB-beroende Luciferasaktivering och kvantifiering av genuttryck i salmonellasmittade vävnadskultur celler

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt och enkelt mäta kärnkrafts faktorn kappa-ljus-Chain-Enhancer av aktiverade B-celler (NF-κb) aktivering i cellinjer som uttrycker NF-κb:: luciferase reporter konstruktioner, via mätningar av luminiscens i cellen lysate. Dessutom är genuttryck bestäms via RT-qPCR isolerade från celler infekterade med salmonella typhimurium.

Abstract

Den dimeriskt transkriptionsfaktorn NF-κb reglerar många cellulära reaktionsvägar, inklusive inflammatoriska vägar genom att inducera uttrycket av olika cytokiner och chemokiner. NF-κB är konstitutivt uttryckt och binds i Cytosol av den hämmande protein nukleära faktorn kappa ljus polypeptid gen förstärkare i B-celler inhibitor, alfa (IκBα). Aktivering av NF-κB kräver nedbrytning av IκBα, som sedan exponerar en nukleär lokaliserings signal på NF-κB och främjar dess människohandel till kärnan. En gång i kärnan, NF-κB binder till promotor regionen NF-κB målgener såsom interleukin 6 (IL-6) och IL-23, att främja deras uttryck.

Aktiveringen av NF-κB sker oberoende av transkription eller översättning. Därför måste aktiveringstillståndet för NF-κB mätas antingen genom att kvantifiera NF-κB specifikt i kärnan, eller genom att kvantifiera uttrycket av NF-κB-målgener. I detta protokoll, celler stabilt transfekterade med en NF-κb:: luciferase reporter konstruera analyseras för NF-κb aktivering med in vitro vävnad kultur tekniker. Dessa celler är infekterade med salmonella typhimurium att aktivera NF-κb, som trafikerar till kärnan och binder till κb platser i promotorn i luciferase, inducera dess uttryck. Celler lyseras och analyseras med luciferas assay system. Mängden luciferas som produceras av cellerna korrelerar med intensiteten av luminiscens signalen, som upptäcks av en Plattläsare. Luminiscens signal som genereras av detta förfarande ger en snabb och mycket känslig metod för att bedöma NF-κb aktivering under en rad olika förhållanden. Detta protokoll utnyttjar också kvantitativ omvänd Transkription PCR (RT-qPCR) för att upptäcka relativa mRNA nivåer som tyder på genuttryck.

Introduction

Den nukleära Factor-κB (NF-κB) protein familjen är viktiga transkription aktivatorer som reglerar genuttryck i olika biologiska vägar. Aktivering av NF-κb inducerar transkription av målgener, av vilka många är viktiga för immun-och inflammatoriska reaktioner, cellproliferation, stressresponser och cancerprogression^1,2. NF-κB spelar en viktig roll i att förmedla tidiga inflammatoriska utfall för patogen clearance. Med tanke på de många biologiska processer medieras av NF-κB aktivering, störningar i dess signalering kan få allvarliga konsekvenser för hälsa och sjukdom. Förlust av funktion mutationer i NF-κB signalering är associerade i flera immunbrist fenotyper, medan vinst av funktion mutationer är förknippade med flera typer av cancer, inklusive B-cells lymfom och bröstcancer³. Dessutom, många patogener har visat sig direkt modulera aktiveringstillståndet för NF-κb genom uttryck av virulensfaktorer^4,5,6,7.

Aktivering av NF-κb är känd för att vara en följd av många variabla stimuli inklusive bakteriella produkter såsom lipopolysackarider (LPS), flagellin och peptidoglykaner kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs). Dessa PAMPs upptäcks av mönsterigenkänning receptorer (PRRs) såsom Toll-liknande receptorer (TLRs) och nicka-liknande receptorer (NLRs) som leder till aktivering av NF-κB och det efterföljande uttrycket av en matris av NF-κB-beroende inflammatoriska gener⁸. Förutom PRR aktivering av PAMPs, andra bakteriella produkter, såsom bakteriella effektorproteiner, kan inducera aktiveringen av NF-κB. Intressant, bakterier också uttrycka effektor proteiner som aktivt dämpa NF-κB väg och förbättra deras patogenicitet, understryker vikten av NF-κB som en viktig medlare av immunitet⁹.

Det finns fem olika subenheter som bildar NF-κB dimers; P50, P52, RelA (P65), RelB och cRel. De två största NF-κb heterodimerer är P50: RelA och P52: relb dimers. De aktiverade NF-κB-dimererna binder till DNA-platser, kända som κB-platser, i promotorn och förstärkare regioner av olika målgener. Under normala homeostatiska förhållanden interagerar NF-κB med en familj av hämmare av proteiner som kallas IκB-proteiner för att förbli inaktiva. Vid stimulering, är IκB fosforyleras av IκB Kinas (IKK), vilket gör att den kan riktas mot ubiquitination, och därefter nedbrytning. Nedbrytning av IκB aktiverar NF-κB genom att avslöja en nukleär lokaliserings signal. NF-κB translokerar sedan till kärnan, där den binder κB-platser i promotionsregionen av målgener och främjar transkription¹⁰. Således, aktivering av NF-κb uppreglerar mRNA uttryck för NF-κb målgener, och denna förändring kan mätas genom RNA kvantifiering analyser såsom RT-qPCR¹¹.

Flera metoder finns och används ofta för mätning av NF-κB aktivering, inklusive elektroforetiska Mobility Shift analyser (EMSA), nukleär translocation, och Gene reporter analyser. EMSA används för att detektera proteinkomplex med nukleinsyror. Stimulerade celler fraktioneras för att isolera nukleära proteiner, inklusive translokaliserat NF-κB, som sedan inkuberas med radiomärkade nukleotider som innehåller den bindande domänen NF-κB. Proverna körs på en gel och avbildas av autoradiografi av ³²P-märkt nukleinsyra. Om NF-κB finns i protein fraktionen, kommer det att binda nukleotider, som kommer att migrera långsammare genom gelen och närvarande som diskreta band. Kärn fraktioner av celler som saknar aktiverad NF-κB (t. ex. ostimulerade kontrollceller) kommer inte att producera några band eftersom nukleotider migrerar snabbare till änden av gelen. En stor nackdel med denna metod är att det är till stor del kvantitativa i binär bemärkelse (dvs, på eller av) och inte tillräckligt fånga meningsfulla skillnader i NF-κB bindande kapacitet. Dessutom anser denna metod inte kromatin strukturer som är funktionellt viktiga för NF-κb målgener^12,13.

I likhet med den tidigare metoden finns det en “non-Shift”-analys där Multiwell-plattor är belagda med nukleotider som innehåller bindningssekvens av NF-κB. Efter behandling av celler med nukleära fraktioner av protein, NF-κB kommer att binda till nukleotider bunden till brunnen. Anti-NF-κB-antikroppar tillsätts sedan, som kommer att interagera med den bundna NF-κB och producera en kolorimetrisk signal proportionell mot mängden NF-κB, vilket indikerar graden av NF-κB-aktivering. Denna metod är fördelaktig över EMSA i att den inte kräver radioaktivt märkt nukleinsyror och är kvantitativ, i jämförelse. Emellertid är ett förbehållet av denna metod att det igen inte gör åtskillnad mellan mellan kromatin påstår av NF-κb riktar gener¹⁴.

En annan metod genom vilken NF-κB aktiveringen kan upptäckas är kromatin immunoprecipitation (ChIP), varvid DNA och samverkande proteiner är tvärbunden med formaldehyd och immunoprecipitated med specifika anti-NF-κB antikroppar. De specifika nukleotidfragmenten renas och identifieras genom PCR-amplifiering eller direkt sekvensering av högt dataflöde. Resultat som genereras från denna metod ger semikvantitativa resultat av NF-κB bindnings aktivitet med målgener. Resultaten är dock i hög grad beroende av fixeringsförhållanden och reningsprocesser vid varje steg¹⁵.

I nukleära flyttning analyser, celler stimuleras att inducera NF-κb aktivering och sedan fast. Anti-P65-antikroppar tillsätts till fasta celler. Alternativt kan själva P65-subenheten taggas med en fluorescerande peptid som grön fluorescerande grön (GFP). I båda fallen, immunofluorescens kommer att möjliggöra avbildning av lokalisering av P65 att bestämma cellulära distributionen. Genom att mäta andelen cytosoliska och nukleärt lokaliserat protein kan utredarna bestämma det relativa aktiveringstillståndet för NF-κb. En nackdel med denna metod är att immunofluorescenen är jämförelsevis tidskrävande, kräver dyra antikroppar, och behöver relativt större teknisk expertis¹⁶.

Reporgengener är ofta använda verktyg för att studera reglerings-och uttrycksmönster för en gen av intresse. Typiskt, reporter gener är konstruerade från Promotorn sekvens av en gen av intresse smält till en gen kodning för ett lätt detekterbart protein. Proteiner med enzymatiska aktiviteter, fluorescens, eller luminiscens egenskaper väljs ofta för deras förmåga att analyseras och kvantifieras. Således fungerar den avlästa (e.g. luminescence, Fluorescence) som en signalera för upptäckt av gen uttryckt. Dessa reporter konstruktioner kan sedan införas i olika celltyper, såsom epitelceller eller makrofager.

Beskrivs i protokollet är användningen av en klonade hela cellinjer (hela 57a) som är stabilt transfekterade med en luciferas reporter som innehåller tre kopior av κb konsensus av immunglobulin κ-kedjan promotor region¹⁷. Uttrycket av luciferas är beroende av aktiveringen av NF-κb, som sker efter cell stimulering. Stimulerade celler lätt lyseras med hjälp av celllysis buffert som tillhandahålls i luciferas assay kit. En del av cellen lysate blandas sedan med luciferas analysbuffert som innehåller Luciferin. Luciferin är substrat för luciferas och krävs för generering av ljus i närvaro av luciferas. Efter att ha kombinerat analysbufferten med lysate, kommer lösningen att avge ljus i en process som kallas luminescence. Mängden ljus som produceras, ges i lumen, är proportionell mot mängden av luciferas som finns i lysat och fungerar som ett mått på NF-κb aktivering. Lumen avläsningar tolkas i jämförelse med en ostimulerad standard för att redogöra för baseline NF-κB aktivitet och signalen i sig är stabil i flera minuter för att möjliggöra tillförlitlig mätning. Dessutom är hela 57a cellinjer stabilt transfekterade med en NF-κb-oberoende β-galaktosidas reporter. Den β-galaktosidas reporter är konstitutivt uttryckt, och β-galaktosidas aktivitet kan mätas för att kontrollera cellernas lönsamhet eller variation i cell nummer¹⁷. Den luciferas värden kan sedan justeras till β-galaktosidas värden och rapporteras som faldig ökning över de ostimulerade kontrollceller.

Eftersom NF-κb är en transkriptionsfaktor som är ansvarig för det ökade uttrycket av NF-κb-beroende målgener, är ett uppföljningsexperiment för att kontrollera för NF-κb-beroende ökat genuttryck kvantitativ omvänd Transkription av polymeras kedjereaktion ( RT-qPCR). RT-qPCR är en mycket känslig metod genom vilken förändringar i genuttrycket kan kvantifieras över flera storleksordningar. Stimulerade och kontrollceller skördas för RNA via fenol-kloroformextraktion. Efter fasseparation extraheras RNA som den viktigaste komponenten i vattenskiktet. RNA fälls sedan ut och spolas för att producera en ren pellet. Denna pellet är sedan rekonstituerad och ytterligare rengöras av förorenat DNA via DNase behandling. Den rena RNA är sedan omvänd transkriberas att skapa kompletterande DNA (cDNA). Detta cDNA kan sedan analyseras genom kvantitativa PCR-tekniker, där överflödet av en specifik mRNA-sekvens kvantifieras för att bestämma genuttryck. Denna teknik belyser inte translationella kontroll, post translationella modifiering, protein överflöd, eller protein aktivitet. Men många gener, särskilt de som är involverade i pro-inflammatoriska processer, regleras via NF-κB och deras mRNA-överflöd är ett tecken på deras uttryck.

Den metod som föreslås här använder ett snabbt och enkelt sätt som NF-κb aktivering kan upptäckas via luminiscens analyser av cellulära lysate. RT-qPCR av NF-κB-målgenuttrycket kan användas för att kvantifiera uttryck för specifika gener, samt validera funktionell aktivitet av NF-κB-aktivering. De stora fördelarna med ett sådant system är dess enkelhet och snabbhet, vilket möjliggör hög genomströmning screening av en rad villkor som modulera NF-κB aktivering. Detta protokoll är lämpligt för andra cellinjer som uttrycker en NF-κb:: luciferase reporter, och har visats i stabilt transfekterade rå 264.7 celler¹⁸. Den tid som krävs för att hantera prover, från cell lysis till att generera en luminiscens signal, är minimal och tar loppet av ungefär en timme. Mätning av NF-κB kräver endast grundläggande laboratorieutrustning såsom ogenomskinliga plattor, en Plattläsare som kan mäta luminescence, och enkla dataanalysprogram som ett kalkylprogram.

Protocol

1. cell Passaging och seedning Behåll HeLa 57A-celler i en 75 cm2 -kolv innehållande 10 ml av Dulbecco ‘ s modifierade Eagle ‘ s media (DMEM) kompletterat med 5% värmeinaktiverat foster bovint serum (FBS) vid 37 ° c i en 5% Co2 -inkubator. Aspirera cell odlingsmedier och tvätta med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA-lösning. Aspirera trypsin och Ersätt med ytterligare 1 mL. Placera kolven i en inkubator på 37 ° c i 4-5 min så att cellerna kan lossna från kolven. Tillsä…

Representative Results

Analysen beskrivs här fokuserar på aktivering av transkriptionsfaktorn NF-κb med hjälp av en NF-κb-beroende luciferas reporter som är stabilt transfekterade till en linje av hela celler. Aktiverade NF-κb receptorn till kärnan där det binder κb bindningsställen för målgener, inklusive de pro-inflammatoriska cytokinerna IL6 och IL23. En allmän översikt över NF-κB-aktiveringen avbildas i figur 1. Den gramnegativa bakterien …

Discussion

Det viktigaste bidraget från protokollet beskrivs är att det ger en snabb och enkel metod för att upptäcka NF-κB aktivering i celler, vilket möjliggör hög genomströmning analys av flera stimulerande villkor eller läkemedel som påverkar NF-κB aktivering. Här, vi beskriver ett protokoll för NF-κB aktivering i salmonella-infekterade hela celler. Dessa celler kan användas för infektion med andra patogener samt för att studera effekten av bakteriell infektion på NF-κB aktivering. Dessutom, NF-κb-…

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate