サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量
Summary
ここでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物を発現する細胞株における活性化B細胞(NF-κB)の核因子カッパ軽鎖増強剤を迅速かつ容易に測定するプロトコルを提示し、細胞溶解物中の発光の測定を行う。さらに、遺伝子発現は、サルモネラ・チフィムリウムに感染した細胞から単離されたRT-qPCRを介して決定される。
Abstract
二量体転写因子NF-κBは、種々のサイトカインおよびケモカインの発現を誘導することによって炎症経路を含む多くの細胞応答経路を調節する。NF-κBは、B細胞阻害剤におけるカッパ光ポリペプチド遺伝子増強剤の阻害性タンパク質核因子によって細胞内で構成的に発現され、隔離される、α(IκBα)である。NF-κBの活性化は、IκBαの分解を必要とし、その後、NF-κB上で核局在化信号を露出させ、核へのその入稿を促進する。いったん核内に入ると、NF−κBはインターロイキン6(IL-6)およびIL-23などのNF−κB標的遺伝子のプロモーター領域に結合し、それらの発現を促進する。
NF-κBの活性化は、転写または翻訳とは独立して起こる。したがって、NF-κBの活性化状態は、核内で特異的にNF-κBを定量するか、またはNF-κB標的遺伝子の発現を定量することによって測定されなければならない。このプロトコルでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞は、in vitro組織培養技術を用いてNF−κB活性化のためにアッセイされる。これらの細胞はサルモネラ・チフィムリウムに感染してNF-κBを活性化し、核に入り込み、ルシフェラーゼのプロモーター領域のκB部位に結合し、その発現を誘導する。細胞はルシフェラーゼアッセイシステムでリゼし、分析される。細胞によって産生されるルシフェラーゼの量は、プレートリーダーによって検出される発光信号の強度と相関する。この手順によって生成される発光信号は、様々な条件下でNF-κB活性化を評価するための迅速かつ高感度な方法を提供します。このプロトコルはまた、遺伝子発現を示す相対mRNAレベルを検出するために定量的逆転写PCR(RT-qPCR)を利用する。
Introduction
タンパク質の核因子-κB(NF-κB)ファミリーは、様々な生物学的経路における遺伝子発現を調節する重要な転写活性化剤である。NF-κBの活性化は、標的遺伝子の転写を誘導し、その多くは免疫および炎症反応、細胞増殖、ストレス応答および癌進行に重要である。NF-κBは、病原体クリアランスのための早期炎症結果を媒取する上で不可欠な役割を果たす。NF-κB活性化によって媒介される多くの生物学的プロセスを考えると、そのシグナル伝達の中断は健康および病気に重大な影響を及ぼす可能性がある。NF-κBシグナル伝達における機能変異の喪失は、いくつかの免疫欠乏表現型に関連しているが、機能変異の獲得は、B細胞リンパ腫および乳癌3を含むいくつかのタイプの癌と関連している。さらに、多くの病原体は、毒性因子4、5、6、7の発現を介してNF−κBの活性化状態を直接調節することが示されている。
NF-κBの活性化は、リポ多糖(LPS)、フラグエリンおよびペプチドグリカン(PamPs)として知られている細菌産物を含む多くの可変刺激の結果であることが知られている。これらのPAMPは、NF-κBの活性化およびNF-κB依存性炎症遺伝子8の配列のその後の発現につながるトール様受容体(TR)およびノッド様受容体(NR)などのパターン認識受容体(PRR)によって検出される。PamPsによるPRR活性化に加えて、細菌エフェクタータンパク質などの他の細菌産物は、NF−κBの活性化を誘導し得る。興味深いことに、細菌はまた、NF−κB経路を積極的に減衰し、その病原性を増強するエフェクタータンパク質を発現し、免疫の必須メディエーターとしてNF-κBの重要性を強調する9。
NF-κBダイマーを形成する5つの異なるサブユニットがあります。p50, p52, RelA (p65), RelB および cRel.2つの主要なNF-κBヘテロダイマーはp50:RelAおよびp52:RelBダイマーである。活性化されたNF-κBダイマーは、κB部位として知られるDNA部位に、種々の標的遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域において結合する。正常な恒常性条件下では、NF-κBはIκBタンパク質として知られている阻害剤タンパク質のファミリーと相互作用し、不活性なままである。刺激の際、IκBはIκBキナーゼ(IKK)によってリン酸化され、ユビキチン化の標的となり、その後の分解を可能にする。IκBの分解は、核局在化信号を明らかにすることによりNF−κBを活性化する。NF-κBは次いで核に転移し、そこで標的遺伝子のプロモーター領域におけるκB部位を結合し、転写10を促進する。従って、NF-κBの活性化は、NF−κB標的遺伝子のmRNA発現をアップレギュレートし、そしてこの変化はRT-qPCR11などのRNA定量アッセイを通じて測定することができる。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、核転座、遺伝子レポーターアッセイなど、NF-κB活性化の測定には、いくつかの方法が存在し、一般的に使用されています。EMSAは、核酸を含むタンパク質複合体を検出するために使用されます。刺激された細胞は、転移したNF-κBを含む核タンパク質を単離するために分画され、その後、NF−κB結合ドメインを含む放射性標識ヌクレオチドでインキュベートされる。サンプルはゲル上で実行され、32P標識核酸の自己放射線撮影によって画像化される。NF-κBがタンパク質画分中に存在する場合、ヌクレオチドは結合し、これはゲルを通してゆっくりと移行し、離散バンドとして存在する。活性化NF-κBを欠く細胞の核分率(例えば、非刺激制御細胞)は、ヌクレオチドがゲルの末端まで速く移行するにつれてバンドを産生しない。この方法の主な欠点は、バイナリーセンス(すなわち、オンまたはオフ)で大部分が定量的であり、NF-κB結合容量の有意な差異を適切に捕捉しないことです。さらに、この方法は、NF−κB標的遺伝子12、13に対して機能的に重要なクロマチン構造を考慮しない。
前の方法と同様に、マルチウェルプレートがNF−κB結合配列を含むヌクレオチドで被覆される「非シフト」アッセイがある。タンパク質の核画分を有する細胞の治療に続いて、NF−κBはウェルに結合したヌクレオチドに結合する。次いで、抗NF-κB抗体が添加され、結合したNF-κBと相互作用し、NF-κBの量に比例した比色シグナルを生成し、NF−κB活性化の程度を示す。この方法は、放射線標識核酸を必要とせず定量的であるという問題でEMSAよりも有利であり、比較して。しかしながら、この方法の注意点は、再びNF−κB標的遺伝子14のクロマチン状態を区別しないことである。
NF-κB活性化が検出され得る別の方法は、クロマチン免疫沈降(ChIP)によるものであり、それによってDNAおよび相互作用タンパク質はホルムアルデヒドと架橋され、特異的な抗NF−κB抗体と免疫沈殿される。その後、特定のヌクレオチド断片を精製し、PCR増幅または直接高スループットシーケンシングを介して同定される。この方法から生成された結果は、標的遺伝子とのNF−κB結合活性の半定量的結果を提供する。しかしながら、結果は各ステップ15における固定条件および精製プロセスに大きく依存する。
核転座アッセイでは、細胞が刺激されNF-κB活性化を誘導し、次いで固定される。抗p65抗体は固定細胞に添加される。あるいは、p65サブユニット自体は、緑色蛍光緑色(GFP)などの蛍光ペプチドでタグ付けすることができる。いずれの場合も、免疫蛍光は、p65の局在化のイメージングを可能にし、細胞分布を決定する。細胞質および核局在タンパク質の割合を測定することにより、研究者はNF−κBの相対的活性化状態を決定することができる。この方法の欠点は、免疫蛍光が比較的時間がかかり、高価な抗体を必要とし、比較的大きな技術的専門知識を必要とすることである。
レポーター遺伝子は、目的の遺伝子の調節パターンおよび発現パターンを研究するために一般的に使用されるツールです。典型的には、レポーター遺伝子は、容易に検出可能なタンパク質をコードする遺伝子に融合された目的遺伝子のプロモーター配列から構築される。酵素活性、蛍光、または発光特性を有するタンパク質は、一般的にアッセイおよび定量化する能力のために選択される。したがって、読み出し(例えば、発光、蛍光)は、遺伝子発現の検出のためのシグナルとして機能する。これらのレポーター構築物は、上皮細胞またはマクロファージなどの異なる細胞型に導入することができる。
プロトコルに記載されているのは、免疫グロブリンκ鎖プロモーター領域17のκBコンセンサスの3つのコピーを含むルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトされたクローンHeLa細胞株(HeLa 57A)の使用である。ルシフェラーゼの発現は、細胞刺激の後に生じるNF-κBの活性化に依存する。刺激された細胞は、ルシフェラーゼアッセイキットに設けられた細胞リシス緩衝液を用いて容易にリンパがされる。次いで、細胞リサートの一部をルシフェリンを含むルシフェラーゼアッセイバッファーと混合する。ルシフェリンはルシフェラーゼの基質であり、ルシフェラーゼの存在下で光を生成するために必要とされる。アッセイバッファーと溶解物を組み合わせた後、溶液は発光と呼ばれるプロセスで光を放出する。生成される光の量は、ルーメンで与えられ、溶解物中に存在するルシフェラーゼの量に比例し、NF−κB活性化の尺度として機能する。ルーメンの読み取り値は、ベースラインNF-κB活性を考慮して非刺激標準と比較して解釈され、信号自体は信頼性の高い測定を可能にするために数分間安定しています。さらに、HeLa 57A細胞株は、NF-κB非依存型βガラクトシダーゼレポーターで安定にトランスフェクトされる。β-ガラクトシダーゼレポーターは構成的に発現され、β-ガラクトシダーゼ活性は、細胞生存率または細胞数17の変動を制御するために測定することができる。ルシフェラーゼ値は、β-ガラクトシダーゼ値に調整し、刺激されない対照細胞のフォールド増加として報告することができる。
NF-κBはNF-κB依存性標的遺伝子の発現増加を担う転写因子であるため、NF-κB依存性増加遺伝子発現を制御するフォローアップ実験は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)。RT-qPCRは、遺伝子発現の変化を数桁にわたって定量することができる高感度な方法です。刺激および対照細胞は、フェノールクロロホルム抽出を介してRNAのために収穫される。相分離の後、RNAは水層の主要成分として抽出される。その後、RNAを沈殿させて洗浄し、純粋なペレットを作製する。このペレットは、DNase処理を介して再構成され、さらに汚染物質DNAを洗浄します。次に、純粋な RNA を逆転写して相補的な DNA (cDNA) を作成します。このcDNAは、特定のmRNA配列の豊富さを定量化して遺伝子発現を決定する定量的PCR技術を通じて分析することができる。この技術は、翻訳制御、翻訳後修飾、タンパク質の存在量、またはタンパク質活性を解明しません。しかしながら、多くの遺伝子、特に炎症前プロセスに関与する遺伝子は、NF-κBを介して調節され、そのmRNAの存在量は、その発現を示す。
ここで提案される方法は、NF-κB活性化が細胞溶解物の発光アッセイを介して検出され得る迅速かつ簡単な方法を利用する。NF-κB標的遺伝子発現のRT-qPCRは、特定の遺伝子の発現を定量化し、NF−κB活性化の機能活性を検証するために使用することができる。このようなシステムの主な利点は、NF-κB活性化を調節する条件の範囲の高スループットスクリーニングを可能にする、そのシンプルさと速度です。このプロトコルは、NF−κB::ルシフェラーゼレポーターを発現する他の細胞株に適しており、かつ安定にトランスフェクトされたRAW264.7細胞18において実証されている。細胞溶解から発光信号の生成まで、サンプルの処理に要する時間は最小限で、約1時間のスパンを要します。NF-κBの測定には、不透明プレートなどの基本的な実験装置、発光を測定できるプレートリーダー、スプレッドシートプログラムなどの単純なデータ解析ソフトウェアのみが必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されているプロトコルの主な貢献は、細胞内のNF-κB活性化を検出する迅速かつ容易な方法を提供し、NF-κB活性化に影響を与える複数の刺激条件または薬物の高スループット分析を可能にすることです。ここでは、サルモネラ菌感染HeLa細胞におけるNF-κB活性化のためのプロトコルについて説明する。これらの細胞は、他の病原体との感染に使用して、NF-κB活性化に対する細菌感染の…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
キーストラ・ゴウンダー研究所での研究は、NIHのNIAIDから賞番号R21AI122092の助成金と、米国糖尿病協会からの賞番号1-18-JDF-035の助成金によって支えられています。
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
Riferimenti
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
