NF-KB-avhengige luciferase aktivisering og kvantifisering av Gene Expression i Salmonella infiserte tissue kultur celler

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å raskt og enkelt måle kjernefysisk faktor Kappa-Light-Chain-Enhancer av aktiverte B-celler (NF-KB) aktivering i cellelinjer uttrykker NF-kB:: luciferase reporter konstruksjoner, via målinger av luminescence i cellen lysat. I tillegg er genuttrykk bestemmes via RT-qPCR isolert fra celler infisert med Salmonella tyfimurium.

Abstract

Den dimeric transkripsjon faktor NF-KB regulerer mange cellulære respons trasé, inkludert inflammatoriske trasé ved å indusere uttrykk for ulike cytokiner og chemokiner. NF-KB er constitutively uttrykt og er sequestered i stoffer av hemmende protein kjernefysiske faktor av Kappa lys polypeptid gen Enhancer i B-cellene inhibitor, Alpha (IκBα). Aktivering av NF-KB krever nedbrytning av IκBα, som deretter eksponerer en kjernefysisk lokalisering signal på NF-KB og fremmer sin smugling til kjernen. En gang i kjernen, NF-KB binder seg til Promotor regionen NF-KB mål gener som interleukin 6 (IL-6) og IL-23, for å fremme sine uttrykk.

Aktiveringen av NF-KB oppstår uavhengig av transkripsjon eller oversettelse. Derfor må aktiveringsstatusen for NF-KB måles enten ved kvantifisere NF-KB spesielt i kjernen, eller ved kvantifisere uttrykk for NF-KB mål gener. I denne protokollen, celler stabilt transfekterte med en NF-kB:: luciferase reporter konstruere er analyseres for NF-KB aktivering ved hjelp av in vitro vev kultur teknikker. Disse cellene er smittet med Salmonella tyfimurium å aktivere NF-KB, som traffics til kjernen og binder seg til KB områder i promoter regionen luciferase, inducing sitt uttrykk. Celler er lysert og analysert med luciferase analysen systemet. Mengden luciferase som produseres av cellene, samsvarer med intensiteten i luminescence signalet, som oppdages av en plate leser. Det luminescence signalet som genereres av denne fremgangsmåten, gir en rask og svært følsom metode for å vurdere aktivering av NF-KB under en rekke betingelser. Denne protokollen benytter også kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) for å oppdage relative mRNA nivåer som er tegn på genuttrykk.

Introduction

Den kjernefysiske faktor-KB (NF-KB) familie av proteiner er viktig transkripsjon aktivator som regulerer genuttrykk i ulike biologiske trasé. Aktivering av NF-KB induserer transkripsjon av målet gener, hvorav mange er viktige for immun-og inflammatoriske reaksjoner, celle spredning, stress svar og kreft progresjon^1,2. NF-KB spiller en integrert rolle i formidling tidlige inflammatoriske utfall for patogen klarering. Gitt de mange biologiske prosesser formidlet av NF-KB aktivering, forstyrrelser i sine signalering kan få alvorlige konsekvenser for helse og sykdom. Tap av funksjon mutasjoner i NF-KB signalering er forbundet i flere uimottakelig mangel fenotyper, mens gevinsten av funksjonen mutasjoner er forbundet med flere typer kreft, inkludert B-celle lymfomer og brystkreft³. I tillegg har mange patogener vist å direkte modulere aktiverings tilstanden til NF-kb gjennom uttrykk for virulens faktorer^4,5,6,7.

Aktivering av NF-KB er kjent for å være en konsekvens av mange variable stimuli inkludert bakterielle produkter som lipopolysaccharides (LPS), flagellin og peptidoglycans kjent som patogen-assosiert molekylær mønstre (PAMPs). Disse PAMPs oppdages av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) som toll-lignende reseptorer (TLRs) og Nod-lignende reseptorer (NLRs) fører til aktivering av NF-KB og den påfølgende uttrykk for en rekke NF-KB-avhengige inflammatoriske gener⁸. I tillegg til PRR aktivering av PAMPs, kan andre bakterielle produkter, for eksempel bakterielle effektor proteiner, indusere aktiveringen av NF-kB. Interessant, bakterier også uttrykke effektor proteiner som aktivt dempe NF-KB veien og forbedre sine patogenitet, understreker viktigheten av NF-KB som en viktig formidler av immunitet⁹.

Det er fem forskjellige under enheter som danner NF-KB dimers; P50, p52, forholdet (P65), RelB og cRel. De to viktigste NF-KB-heterodimerer er P50: forholdet og p52: RelB dimers. Den aktiverte NF-KB dimers binder til DNA-områder, kjent som KB nettsteder, i promoter og Enhancer regioner av ulike mål gener. Under normale homøostatisk forhold, NF-KB samhandler med en familie av inhibitor proteiner kjent som IκB proteiner å være inaktiv. Ved stimulering, IκB er fosforylert av IκB kinase (IKK), som gjør det mulig å være målrettet for ubiqitinering, og senere degradering. Nedbrytning av IκB aktiverer NF-KB ved å avsløre et kjernefysisk lokaliserings signal. NF-KB deretter translocates til kjernen, der det binder KB områder i arrangøren regionen mål gener og fremme transkripsjon¹⁰. Dermed aktivering av NF-KB upregulates mRNA uttrykk for NF-KB mål gener, og denne endringen kan måles gjennom RNA kvantifisering analyser som RT-qPCR¹¹.

Det finnes flere metoder og brukes vanligvis for måling av NF-KB aktivering, inkludert Elektroforetiske mobilitet Skift analyser (EMSA), kjernefysiske translokasjon og gen reporter analyser. EMSA brukes til å oppdage protein komplekser med nukleinsyre syrer. Stimulert celler er fraksjonert å isolere kjernefysiske proteiner, inkludert translocated NF-KB, som deretter inkubert med radiolabeled nukleotider inneholder NF-KB bindende domenet. Prøvene er kjørt på en gel og avbildet av autoradiografi av ³²P-merket nukleinsyre syre. Hvis NF-KB er til stede i proteinet brøkdel, vil det binde nukleotider, som vil migrere tregere gjennom gel og presentere som diskrete band. Kjernefysiske fraksjoner av celler som mangler aktivert NF-KB (for eksempel unstimulated kontroll celler) vil produsere noen band som nukleotider migrere raskere til slutten av gelen. En stor ulempe med denne metoden er at det i stor grad er kvantitativ i binær forstand (dvs. på eller av) og ikke tilstrekkelig fange meningsfulle forskjeller i NF-KB bindende kapasitet. I tillegg denne metoden ikke anser kromatin strukturer som er funksjonelt viktig for NF-KB målet gener^12,13.

I likhet med den forrige metoden, det er en “ikke-Shift”-analysen der multi-brønn platene er belagt med nukleotider inneholder NF-KB bindende sekvens. Etter behandling av celler med kjernefysiske fraksjoner av protein, NF-KB vil binde til nukleotider bundet til brønnen. Anti-NF-KB antistoffer blir deretter lagt til, som vil samhandle med den bundne NF-KB og produsere et fargemetrisk signal proporsjonal med mengden av NF-KB, som indikerer graden av NF-KB-aktivering. Denne metoden er fordelaktig over EMSA ved at den ikke krever radiolabeled nukleinsyre syrer og er kvantitativ, i sammenligning. Men en påminnelse om denne metoden er at det igjen ikke skiller mellom kromatin statene NF-KB målet gener¹⁴.

En annen metode som NF-KB aktivering kan oppdages er av kromatin immunutfelling (ChIP), hvorved DNA og samspill proteiner er kryss-knyttet til formaldehyd og immunoprecipitated med spesifikke anti-NF-KB antistoffer. De spesifikke nukleotid fragmentene blir deretter renset og identifisert gjennom PCR forsterkning eller direkte høy gjennomstrømming sekvensering. Resultater generert fra denne metoden gir semi-kvantitative resultater av NF-KB bindende aktivitet med mål gener. Imidlertid er resultatene svært avhengig av fiksering forhold og rensing prosesser på hvert trinn¹⁵.

I kjernefysiske translokasjon analyser, celler stimuleres til å indusere NF-KB aktivering og deretter fast. Anti-P65 antistoffer legges til faste celler. Alternativt kan P65 delenhet selv være merket med et fluorescerende peptid som grønn fluorescerende grønn (GFP). I begge tilfeller, immunofluorescence ville tillate tenkelig av lokaliseringen av P65 å avgjøre Cellular distribusjon. Ved å måle andelen av cytosolic og kjernefysiske lokaliserte protein, kan etterforskere bestemme relativ aktiveringstilstand NF-kB. En ulempe med denne metoden er at immunofluorescence er forholdsvis tidkrevende, krever kostbare antistoffer, og trenger relativt større teknisk ekspertise¹⁶.

Reporter gener er ofte brukt verktøy for å studere regelverket og uttrykk mønstre av et gen av interesse. Vanligvis er reporter gener konstruert fra arrangøren sekvensen av et gen av interesse smeltet til et gen koding for et lett synlig protein. Proteiner med enzymatisk aktivitet, fluorescens, eller luminescence egenskaper er ofte valgt for deres evne til å være analyseres og kvantifisert. Således, det lese-ut (e.g., luminescence, fluorescens) behandler som signal for oppdagelsen av det gen gjengivelsen. Disse reporter konstruksjoner kan deretter innføres i ulike celletyper, for eksempel epitelceller eller makrofager.

Beskrevet i protokollen er bruken av en klonet HeLa cellelinje (HeLa 57A) som er stabilt transfekterte med en luciferase reporter som inneholder tre eksemplarer av KB konsensus av immunglobulin ĸ-kjeden promoter region¹⁷. Uttrykk for luciferase er avhengig av aktiveringen av NF-KB, som oppstår etter celle stimulering. Stimulert celler er lett lysert ved hjelp av cellelyse Rings buffer gitt i luciferase analysen Kit. En del av celle lysat blandes deretter med luciferase analysebuffer som inneholder luciferin. Luciferin er underlaget av luciferase og er nødvendig for generering av lys i nærvær av luciferase. Etter å kombinere analysen buffer med lysat, vil løsningen avgir lys i en prosess kjent som luminescence. Mengden av lys produsert, gitt i lumen, er proporsjonal med mengden av luciferase tilstede i lysat og fungerer som et mål på NF-KB aktivering. Lumen målingene tolkes i forhold til en unstimulated standard å ta hensyn til Baseline NF-KB aktivitet og signalet i seg selv er stabil i flere minutter for å muliggjøre pålitelig måling. I tillegg er HeLa 57A cellelinjen stabilt transfekterte med en NF-KB-Independent β-galaktosidase reporter. Β-galaktosidase reporter er constitutively uttrykt, og β-galaktosidase aktivitet kan måles for å kontrollere for celle levedyktighet eller variasjon i celle tall¹⁷. De luciferase verdiene kan deretter justeres til β-galaktosidase verdier og rapporteres som fold økning over unstimulated kontroll celler.

Siden NF-KB er en transkripsjon faktor ansvarlig for økt uttrykk for NF-KB-avhengige mål gener, et oppfølgingseksperiment for å kontrollere for NF-KB-avhengige økt genuttrykk er kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon ( RT-qPCR). RT-qPCR er en svært følsom metode der endringer i genuttrykket kan kvantifisert over flere størrelsesordener. Stimulert og kontroll celler høstes for RNA via fenol-kloroform ekstraksjon. Etter fase separasjon trekkes RNA ut som hovedkomponenten i det vandige laget. RNA-en blir deretter utløst og vasket for å produsere en ren pellet. Denne pellet blir deretter rekonstituert og ytterligere rengjort av forurensende DNA via DNase behandling. Den rene RNA-en blir deretter omvendt for å skape utfyllende DNA (cDNA). Denne cDNA kan deretter analyseres gjennom kvantitative PCR-teknikker, der overflod av en bestemt mRNA-sekvens er kvantifisert for å avgjøre genuttrykk. Denne teknikken ikke belyse translational kontroll, post translational modifikasjon, protein overflod, eller protein aktivitet. Men mange gener, spesielt de som er involvert i Pro-inflammatoriske prosesser, er regulert via NF-KB og deres mRNA overflod er en indikasjon på deres uttrykk.

Metoden foreslo her utnytter en rask og enkel måte som NF-KB aktivering kan oppdages via luminescence analyser av mobilnettet lysat. RT-qPCR av NF-KB mål genuttrykk kan brukes til å kvantifisere uttrykk for bestemte gener, samt validere funksjonell aktivitet av NF-KB aktivering. De store fordelene med et slikt system er dens enkelhet og hastighet, noe som gjør det mulig for høy gjennomstrømming screening av en rekke forhold som modulere NF-KB aktivering. Denne protokollen er egnet for andre cellelinjer uttrykker en NF-kB:: luciferase reporter, og har blitt demonstrert i stabilt transfekterte RAW 264.7 celler¹⁸. Mengden tid som kreves for å håndtere prøver, fra cellelyse til å generere en luminescence signal, er minimal og tar span av omtrent en time. Måling av NF-KB krever bare grunnleggende laboratorieutstyr som ugjennomsiktige plater, en plate leser som kan måle luminescence, og enkel dataanalyse programvare, for eksempel et regnearkprogram.

Protocol

1. Cell Passaging og seeding Oppretthold HeLa 57A celler i en 75 cm2 kolbe som inneholder 10 ml av Dulbecco ‘ s modifiserte Eagle ‘ s Media (DMEM) supplert med 5% varme deaktivert fosterets storfe serum (FBS) ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator. Aspirer cellekultur medier og vask med 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA-løsning. Aspirer Trypsin og Skift ut med ytterligere 1 mL. Plasser flasken i et 37 ° c inkubator for 4-5 min slik at cellene kan løsne fra kolbe. Tilsett 9 mL celle…

Representative Results

Analysen beskrevet her fokuserer på aktivering av transkripsjon faktoren NF-KB ved hjelp av en NF-KB-avhengige luciferase reporter som er stabilt transfekterte i en linje av HeLa celler. Aktivert NF-KB translocates til kjernen der det binder KB bindende områder av mål gener, inkludert Pro-inflammatorisk cytokiner IL6 og IL23. En generell oversikt over NF-KB-aktivering er avbildet i figur 1. Den gram-negative bakterien Salmonella enter…

Discussion

Den store bidrag av protokollen som er beskrevet er at det gir en rask og enkel metode for å oppdage NF-KB aktivering i celler, som gjør det mulig for høy gjennomstrømming analyse av flere stimulerende forhold eller medikamenter som påvirker NF-KB aktivering. Her beskriver vi en protokoll for NF-KB aktivering i Salmonella-infiserte HeLa celler. Disse cellene kan brukes til infeksjon med andre patogener i tillegg til å studere virkningen av bakteriell infeksjon på NF-KB aktivering. I tillegg kan NF-KB-avhe…

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate