Salmonella Enfekte Doku Kültür Hücrelerinde NF-κB bağımlı Luciferase Aktivasyonu ve Gen Ekspresyonunun Nicelleştirilmesi
Summary
Burada, nf-κB::luciferase reporter constructs,hücre lysate parlaklık ölçümleri yoluyla, hücre hatlarında aktif B hücrelerinin (NF-κB) aktivasyonunun nükleer faktör kappa-ışık-zincir arttırıcısını hızlı ve kolay bir şekilde ölçmek için bir protokol saklıyız. Ayrıca, gen ekspresyonu Salmonella Typhimurium ile enfekte hücrelerden izole RT-qPCR ile belirlenir.
Abstract
Dimerik transkripsiyon faktörü NF-κB çeşitli sitokinler ve kemokinler ifade indükleyerek inflamatuar yollar da dahil olmak üzere birçok hücresel yanıt yollarını düzenler. NF-κB konstitutively ifade edilir ve B hücreleri inhibitörü kappa ışık polipeptid gen arttırıcı inhibitör protein nükleer faktör tarafından sitosol içinde sekestre edilir, alfa (IκBα). NF-κB’nin aktivasyonu, IκBα’nın bozulmasını gerektirir, bu da NF-κB’de nükleer bir lokalizasyon sinyalini ortaya çıkarır ve çekirdeğin ticaretini teşvik eder. Çekirdekte nf-κB, ininterlökin 6 (IL-6) ve IL-23 gibi nf-κB hedef genlerinin promotor bölgesine bağlanır ve ekspresyonların dışavurumlarını destekler.
NF-κB’nin aktivasyonu transkripsiyon veya çeviriden bağımsız olarak gerçekleşir. Bu nedenle, NF-κB’nin aktivasyon durumu, nf-κB’nin özellikle çekirdekteki sayısallaştırılması veya NF-κB hedef genlerinin ifadelerinin ölçülmesi ile ölçülmelidir. Bu protokolde, nf-κB ile transfeced hücreler::luciferase muhabir yapısı in vitro doku kültürü teknikleri kullanılarak NF-κB aktivasyonu için test edilir. Bu hücreler Salmonella Typhimurium ile enfekte nf-κB etkinleştirmek için, hangi çekirdeğe trafik ve luciferase organizatörü bölgede κB sitelerine bağlanır, ifadesini indükleyen. Hücreler lysed ve luciferase test sistemi ile analiz edilir. Hücreler tarafından üretilen luciferase miktarı bir plaka okuyucu tarafından algılanan lüminesans sinyalinin yoğunluğu ile ilişkilidir. Bu yordam tarafından oluşturulan Parlaklık sinyali, NF-κB aktivasyonunu çeşitli koşullar altında değerlendirmek için hızlı ve son derece hassas bir yöntem sağlar. Bu protokol aynı zamanda gen ekspresyonunun göstergesi olan bağıl mRNA düzeylerini saptamak için kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) kullanır.
Introduction
Nükleer faktör-κB (NF-κB) protein ailesi, çeşitli biyolojik yollarda gen ekspresyonunu düzenleyen önemli transkripsiyon aktivatörleridir. NF-κB aktivasyonu hedef genlerin transkripsiyon indükler, birçoğu bağışıklık ve inflamatuar yanıtlar için önemlidir, hücre çoğalması, stres yanıtları ve kanser ilerlemesi1,2. NF-κB patojen temizliği için erken inflamatuar sonuçlar aracılık ayrılmaz bir rol oynar. NF-κB aktivasyonunun aracılık ettiği birçok biyolojik süreç göz önüne alındığında, sinyalizasyonundaki aksaklıklar sağlık ve hastalık açısından ciddi sonuçlar doğurabilir. NF-κB sinyalizasyonunda fonksiyon mutasyonlarının kaybı çeşitli immün yetmezlik fenotiplerinde ilişkilidir, fonksiyon mutasyonlarının kazanımı ise B hücreli lenfomalar ve meme kanserleri de dahil olmak üzere çeşitli kanser türleri ile ilişkilidir3. Ayrıca, birçok patojenler doğrudan virülansfaktörlerininekspresyonu ile NF-κB aktivasyon durumunu modüle gösterilmiştir 4,5,6,7.
NF-κB aktivasyonu, patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP) olarak bilinen lipopolisakkaritler (LPS), flagellin ve peptidoglikanlar gibi bakteriyel ürünler de dahil olmak üzere birçok değişken uyaranların bir sonucu olarak bilinmektedir. Bu PAMP’ler, NF-κB aktivasyonuna ve NF-κB’ye bağlı inflamatuar genlerin bir dizi sinin sonraki ekspresyonuna yol açan Toll benzeri reseptörler (TLR) ve Nod benzeri reseptörler (NLR) gibi patern tanıma reseptörleri (PrR’ ler) tarafından tespit edilir8. PAMP’ler tarafından PRR aktivasyonuna ek olarak, bakteriyel efektör proteinler gibi diğer bakteriyel ürünler NF-κB aktivasyonuna neden olabilir. İlginçtir, bakteriler de aktif NF-κB yolu zayıflatmak ve patojenik geliştirmek etkileyici proteinlerifade, bağışıklık önemli bir aracı olarak NF-κB önemini vurgulayan9.
NF-κB dimer’lerini oluşturan beş farklı alt birim vardır; p50, p52, RelA (p65), RelB ve cRel. İki ana NF-κB heterodimerp50:RelA ve p52:RelB dimers vardır. Aktif NF-κB dimers ÇEŞITLI hedef genlerin organizatörü ve arttırıcı bölgelerde, κB siteleri olarak bilinen DNA sitelerine bağlanır. Normal homeostatik koşullar altında, NF-κB inhibisyon proteinleri olarak bilinen bir aile ile etkileşime girebilmekte olup inaktif kalır. Uyarılma üzerine, IκB IκB Kinase (IKK) tarafından fosforile edilir, hangi her yerde hedeflenmesağlar, ve daha sonra bozulma. IκB’nin bozulması, nükleer bir lokalizasyon sinyali ortaya çıkararak NF-κB’yi harekete geçirir. NF-κB daha sonra çekirdeğe aktarır ve burada hedef genlerin promotör bölgesindeki κB sitelerini bağlar ve transkripsiyon10’uteşvik eder. Böylece NF-κB’nin aktivasyonu NF-κB hedef genlerinin mRNA ekspresyonunu düzenler ve bu değişiklik RT-qPCR11gibi RNA niceleme leri ile ölçülebilir.
Elektroforetik hareketlilik kayması tahlilleri (EMSA), nükleer translokasyon ve gen muhabiri tahlilleri de dahil olmak üzere NF-κB aktivasyonunun ölçümü için yaygın olarak kullanılan çeşitli yöntemler vardır. EMSA nükleik asitler ile protein kompleksleri tespit etmek için kullanılır. Uyarılmış hücreler nükleer proteinleri izole etmek için fraksiyona alınırlar, transreretik NF-κB de dahil olmak üzere, daha sonra NF-κB bağlayıcı etki alanını içeren radyoetiketli nükleotitlerle kuluçkaya yatırılır. Örnekler bir jel üzerinde çalıştırılır ve 32P etiketli nükleik asit otoradyografi ile görüntülenir. Protein fraksiyonunda NF-κB mevcutsa, jel den daha yavaş göç edecek ve ayrıbantlar halinde mevcut olan nükleotitleri bağlar. Aktif NF-κB’den yoksun hücrelerin nükleer fraksiyonları (örneğin, uyarılmamış kontrol hücreleri) nükleotitler jelin ucuna daha hızlı göç ettikçe hiçbir bant üretmez. Bu yöntemin önemli bir dezavantajı, ikili anlamda büyük ölçüde nicel olmasıdır (yani, açık veya kapalı) ve NF-κB bağlama kapasitesinde anlamlı farklılıkları yeterince yakalayamamaktır. Ayrıca, bu yöntem fonksiyonel NF-κB hedef genler için önemli olan kromatin yapıları dikkate almaz12,13.
Önceki yönteme benzer şekilde, çok kuyulu plakaların NF-κB bağlama dizisini içeren nükleotitlerle kaplandığı bir “kaymaz” töz vardır. Proteinlerin nükleer fraksiyonları ile hücrelerin tedavisisonrasında, NF-κB kuyuya bağlı nükleotitlere bağlanır. Daha sonra anti-NF-κB antikorları eklenir, bu da bağlı NF-κB ile etkileşime girerek NF-κB miktarıyla orantılı olarak nf-κB aktivasyon derecesini gösteren kolorimetrik bir sinyal üretir. Bu yöntem, radyoetiketli nükleik asitler gerektirmemesi ve karşılaştırmaaçısından nicel olması nedeniyle EMSA’ya göre avantajlıdır. Ancak, bu yöntemin bir uyarı yine NF-κB hedef genlerin kromatin durumları arasında ayrım yapmaz14.
NF-κB aktivasyonunun saptabildiği bir diğer yöntem de kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) ile, DNA ve etkileşen proteinler formaldehit ile çapraz bağlanır ve spesifik anti-NF-κB antikorları ile immünopsipatatedilir. Belirli nükleotid parçaları daha sonra saflaştırılır ve PCR amplifikasyon veya doğrudan yüksek iş elde etme sıralaması ile tanımlanır. Bu yöntemden elde edilen sonuçlar, NF-κB bağlama aktivitesinin hedef genlerle yarı kantitatif sonuçlarını sağlar. Ancak, sonuçlar son derece heradım15de fiksasyon koşulları ve arıtma işlemleri bağlıdır.
Nükleer translokasyon tahlillerinde hücreler NF-κB aktivasyonunu tetiklemek için uyarılır ve sonra sabitlenir. Sabit hücrelere anti-p65 antikorları eklenir. Alternatif olarak, p65 alt biriminin kendisi yeşil floresan yeşil (GFP) gibi floresan peptid ile etiketlenebilir. Her iki durumda da, immünofluorescence hücresel dağılımı belirlemek için p65 lokalizasyonu görüntüleme sağlayacaktır. Araştırmacılar, sitosolik ve nükleer lokalize protein oranını ölçerek NF-κB’nin göreli aktivasyon durumunu belirleyebilirler. Bu yöntemin bir dezavantajı immünfloresans nispeten zaman alıcı olmasıdır, pahalı antikorlar gerektirir, ve nispeten daha fazla teknik uzmanlık ihtiyacı16.
Muhabir genler, ilgi çeken bir genin düzenleyici ve ifade kalıplarını incelemek için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Tipik olarak, muhabir genler kolayca tespit edilebilir bir protein için kodlayan bir gen erimiş ilgi geninin promotör dizisinden inşa edilmiştir. Enzimatik aktiviteler, floresan veya lüminesans özellikleri olan proteinler genellikle analiz ve nicel yetenekleri için seçilir. Böylece, okuma (örneğin, parlaklık, floresan) gen ekspresyonunun saptanması için bir sinyal görevi göremez. Bu muhabir yapıları daha sonra epitel hücreleri veya makrofajlar gibi farklı hücre türlerine tanıtılabilir.
Protokolde açıklanan bir klonlanmış HeLa hücre hattı kullanımı (HeLa 57A) bir luciferase muhabiri ile immünglobulin κ-chain promoter bölge κB konsensüs üç kopyasını içeren bir transfected17. Luciferase ekspresyonu hücre stimülasyonu sonrasında ortaya çıkan NF-κB aktivasyonuna bağlıdır. Uyarılmış hücreler luciferase tsay kitinde sağlanan hücre lisis tamponu kullanılarak kolayca lysed edilir. Hücre lisate bir kısmı daha sonra luciferin içeren luciferase tsay tampon ile karıştırılır. Luciferin luciferase substrat ve luciferase varlığında ışık üretimi için gereklidir. Israr tamponu ile lysate birleştirdikten sonra, çözüm Lüminesans olarak bilinen bir süreçte ışık yayar. Lümenlerde üretilen ışık miktarı, lysate’de bulunan luciferase miktarı ile orantılıdır ve NF-κB aktivasyonunun bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Lümen okumaları, temel NF-κB aktivitesini hesaba katmak için uyarılmamış bir standarda göre yorumlanır ve sinyalin kendisi güvenilir ölçüm için birkaç dakika stabildir. Buna ek olarak, HeLa 57A hücre hattı stfecably bir NF-κB-bağımsız β-galactosidaz muhabiri ile transfected. Β-galaktosidaz muhabiri kurucu olarak ifade edilir ve β-galaktosidaz aktivitesi hücre canlılığını veya hücre sayılarında değişimi kontrol etmek için ölçülebilir17. Luciferase değerleri daha sonra β-galaktosidaz değerlerine ayarlanabilir ve uyarılmamış kontrol hücreleri üzerinde kat artış olarak rapor edilebilir.
NF-κB, NF-κB bağımlı hedef genlerin artan ekspresyonundan sorumlu bir transkripsiyon faktörü olduğundan, NF-κB bağımlı artmış gen ekspresyonunu kontrol etmek için yapılan bir takip deneyi nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonudur ( RT-qPCR). RT-qPCR, gen ekspresyonundaki değişikliklerin çeşitli büyüklük sıraları üzerinden ölçülebildiği son derece hassas bir yöntemdir. Uyarılmış ve kontrol hücreleri fenol-kloroform ekstraksiyon u yoluyla RNA için hasat edilir. Faz ayrımından sonra, RNA sulu tabakanın ana bileşeni olarak ayıklanır. RNA daha sonra çökeltilir ve saf pelet üretmek için yıkanır. Bu pelet daha sonra yeniden yapılır ve DNase tedavisi ile kirletici DNA’dan daha fazla temizlenir. Saf RNA sonra tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturmak için transkripsiyonu ters yazılır. Bu cDNA daha sonra belirli bir mRNA dizisinin bolluğunun gen ekspresyonunu belirlemek için ölçüldüğü nicel PCR teknikleri ile analiz edilebilir. Bu teknik çevirisel kontrolü, çeviri sonrası modifikasyonu, protein bolluğunu veya protein aktivitesini açıklamaz. Ancak, birçok gen, özellikle pro-inflamatuar süreçlerde yer alanlar, NF-κB ile düzenlenir ve mRNA bolluğu onların ifadelerinin göstergesidir.
Burada önerilen yöntem, NF-κB aktivasyonunun hücresel lysate’nin lüminesans tahlilleri ile saptanabileceği hızlı ve basit bir yöntem kullanır. NF-κB hedef gen ekspresyonunun RT-qPCR’ı belirli genlerin ekspresyonunu ölçmek ve NF-κB aktivasyonunun fonksiyonel aktivitesini doğrulamak için kullanılabilir. Böyle bir sistemin en büyük avantajları, NF-κB aktivasyonunu modüle eden bir dizi koşulun yüksek iş gücü taramasına olanak tanıyan sadeliği ve hızıdır. Bu protokol bir NF-κB ifade diğer hücre hatları için uygundur::luciferase muhabiri, ve stable transfected RAW264.7 hücreleri18gösterilmiştir . Hücre lisisinden itibaren bir lüminesans sinyali oluşturmaya kadar numuneleri işlemek için gereken süre çok azdır ve yaklaşık bir saatlik bir zaman dilimini alır. NF-κB ölçümü sadece opak plakalar, parlaklığı ölçebilen bir plaka okuyucu ve elektronik tablo programı gibi basit veri analizi yazılımları gibi temel laboratuvar ekipmanı gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokolün en önemli katkısı, hücrelerde NF-κB aktivasyonunu saptamak için hızlı ve kolay bir yöntem sunmasıdır, bu da birden fazla uyarıcı koşulun veya NF-κB aktivasyonunu etkileyen ilaçların yüksek iş analizine olanak sağlar. Burada Salmonellaenfekte HeLa hücrelerinde NF-κB aktivasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Bu hücreler diğer patojenler ile enfeksiyon için yanı sıra NF-κB aktivasyonu bakteriyel enfeksiyonun etkisini incelemek için kullanılabilir. Buna ek o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keestra-Gounder laboratuvarındaki araştırmalar, NIH’nin NIAID’inin R21AI122092 Ödülü kapsamında ve Amerikan Diyabet Derneği’nin 1-18-JDF-035 ödül numarası altında verdiği bağışlarla desteklenmiştir.
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
Riferimenti
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
