Test d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin dans un modèle de boucle de flux imitant le flux sanguin humain
Summary
Ce protocole décrit une évaluation complète de l’hémocompatibilité des dispositifs de contact sanguin à l’aide d’implants neurovasculaires découpés au laser. Un modèle de boucle de flux avec du sang humain frais et héparinisé est appliqué pour imiter le flux sanguin. Après perfusion, divers marqueurs hématologiques sont analysés et comparés aux valeurs acquises directement après la collecte de sang pour l’évaluation d’hémocompatibilité des dispositifs testés.
Abstract
L’utilisation croissante de dispositifs médicaux (p. ex. greffes vasculaires, endoprothèses et cathéters cardiaques) à des fins temporaires ou permanentes qui demeurent dans le système circulatoire de l’organisme exige une approche fiable et multiparamétrique qui évalue les complications hématologiques possibles causées par ces dispositifs (c.-à-d. l’activation et la destruction des composants sanguins). L’essai complet d’hémocompatibilité in vitro des implants de contact sanguin est la première étape vers la mise en œuvre in vivo réussie. Par conséquent, une analyse approfondie selon l’Organisation internationale pour la normalisation 10993-4 (ISO 10993-4) est obligatoire avant l’application clinique. La boucle de débit présentée décrit un modèle sensible pour analyser les performances hémostatiques des endoprothèses (dans ce cas, neurovasculaire) et révéler des effets indésirables. L’utilisation du sang entier humain frais et l’échantillonnage doux du sang sont essentiels pour éviter la préactivation du sang. Le sang est perfusé à travers un tube héparinisé contenant le spécimen d’essai à l’aide d’une pompe périssaltique à un taux de 150 ml/min à 37 oC pendant 60 min. Avant et après la perfusion, marqueurs hématologiques (c.-à-d. la numération des cellules sanguines, l’hémoglobine, l’hématocrit et les marqueurs plasmatiques) indiquant l’activation des leucocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), des plaquettes (-thromboglobuline), du système de coagulation (thombin-antithrombin III [TAT]), et de la cascade de complément (SC5b-9) sont analysées. En conclusion, nous présentons un modèle essentiel et fiable pour des tests d’hémocompatibilité étendus des endoprothèses et autres dispositifs de contact sanguin avant l’application clinique.
Introduction
L’application in vivo d’implants et de biomatériaux, qui interagissent avec le sang humain, nécessite des tests précliniques intenses axés sur l’étude de divers marqueurs du système hémostatique. L’Organisation internationale pour la normalisation 10993-4 (ISO 10993-4) précise les principes centraux pour l’évaluation des dispositifs de contact sanguin (c.-à-d. les endoprothèses et les greffes vasculaires) et considère la conception de l’appareil, l’utilité clinique et les matériaux nécessaires1.
Le sang humain est un liquide qui contient diverses protéines et cellules plasmatiques, y compris les leucocytes (globules blancs [WBC]), les érythrocytes (globules rouges [RBC]), et les plaquettes, qui effectuent des fonctions complexes dans le corps humain2. Le contact direct des matériaux étrangers avec le sang peut causer des effets indésirables, tels que l’activation du système immunitaire ou de coagulation, qui peut conduire à une inflammation ou des complications thrombotiques et des problèmes graves après l’implantation3,4,5. Parconséquent, la validation d’hémocompatibilité in vitro offre une occasion avant l’implantation de détecter et d’exclure toutes les complications hématologiques qui peuvent être induites au contact du sang avec une surface étrangère6.
Le modèle présenté de boucle d’écoulement a été établi pour évaluer l’hémocompatibilité des endoprothèses neurovasculaires et des dispositifs similaires en appliquant un débit de 150 ml/min dans les tubes (diamètre de 3,2 mm) pour imiter les conditions de débit cérébral et les diamètres de l’artère2,7. Outre la nécessité d’un modèle in vitro optimal, la source de sang est un facteur important dans l’obtention de résultats fiables et inchangés lors de l’analyse de l’hémocompatibilité d’un biomatériau8. Le sang recueilli doit être utilisé immédiatement après l’échantillonnage afin d’éviter les changements causés par un stockage prolongé. En général, une douce collecte de sang sans stase à l’aide d’une aiguille de 21 G devrait être effectuée pour minimiser la préactivation des plaquettes et la cascade de coagulation pendant le prélèvement sanguin. En outre, les critères d’exclusion des donneurs comprennent ceux qui fument, sont enceintes, sont en mauvais état de santé ou ont pris des contraceptifs oraux ou des analgésiques au cours des 14 jours précédents.
Cette étude décrit un modèle in vitro pour les tests d’hémocompatibilité étendu des implants endoprothèses dans des conditions d’écoulement. En comparant les endoprothèses non couchées aux endoprothèses enduites de fibrine-heparin, les résultats des tests complets d’hémocompatibilité reflètent une amélioration de l’hémocompatibilité des endoprothèses enduites de fibrine-héparine9. En revanche, les endoprothèses non enduites induisent l’activation de la cascade de coagulation, comme en témoigne l’augmentation des concentrations de thombin-antithrombin III (TAT) et la perte du nombre de plaquettes sanguines due à l’adhérence des plaquettes à la surface en endoprothèse. Dans l’ensemble, l’intégration de ce modèle d’hémocompatibilité comme un test préclinique est recommandée pour détecter tout effet indésirable sur le système hémostatique qui sont causés par l’appareil.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté décrit une méthode complète et fiable pour l’essai d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin conformément à ISO 10993-4 dans un modèle de débit de cisaillement imitant le flux sanguin humain. Cette étude est basée sur l’essai d’implants neurovasculaires découpés au laser, mais peut être réalisée avec une variété d’échantillons. Les résultats démontrent que cette méthode permet l’analyse large de divers paramètres tels que la numération des cellules san…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pour la performance de la microscopie électronique à balayage, nous remercions Ernst Schweizer de la section des sciences et de la technologie des matériaux médicaux de l’hôpital universitaire de Tuebingen. La recherche a été soutenue par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports du CR dans le cadre du Programme national de développement durable II (Projet BIOCEV-FAR LQ1604) et par le projet no 18-01163S de la Fondation scientifique tchèque.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
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