Pruebas de hemocompatibilidad de implantes que contactan con la sangre en un modelo de bucle de flujo que imita el flujo sanguíneo humano
Summary
Este protocolo describe una evaluación completa de la hemocompatibilidad de los dispositivos de contacto con la sangre mediante implantes neurovasculares cortados por láser. Se aplica un modelo de bucle de flujo con sangre humana fresca y heparinizada para imitar el flujo sanguíneo. Después de la perfusión, se analizan varios marcadores hematológicos y se comparan con los valores obtenidos directamente después de la recolección de sangre para la evaluación de la hemocompatibilidad de los dispositivos probados.
Abstract
El uso creciente de dispositivos médicos (por ejemplo, injertos vasculares, stents y catéteres cardíacos) con fines temporales o permanentes que permanecen en el sistema circulatorio del cuerpo exige un enfoque fiable y multiparamétrico que evalúe las posibles complicaciones hematológicas causadas por estos dispositivos (es decir, la activación y destrucción de los componentes sanguíneos). La prueba integral de hemocompatibilidad in vitro de los implantes que contactan con la sangre es el primer paso hacia una implementación in vivo exitosa. Por lo tanto, un análisis exhaustivo según la Organización Internacional de Normalización 10993-4 (ISO 10993-4) es obligatorio antes de la aplicación clínica. El bucle de flujo presentado describe un modelo sensible para analizar el rendimiento hemostático de los stents (en este caso, neurovascular) y revelar efectos adversos. El uso de sangre entera humana fresca y un muestreo suave de sangre son esenciales para evitar la preactivación de la sangre. La sangre se perfunde a través de un tubo heparinizado que contiene la muestra de ensayo mediante el uso de una bomba peristáltica a una velocidad de 150 ml/min a 37 oC durante 60 min. Antes y después de la perfusión, los marcadores hematológicos (es decir, recuento de células sanguíneas, hemoglobina, hematocrito y marcadores plasmáticos) que indican la activación de leucocitos (polimorfonucleares [PMN]-elastasa), plaquetas (-tromboglobulina [-TG]), el sistema de coagulación (thombin-antitrombina III [TAT]), y la cascada de sc- En conclusión, presentamos un modelo esencial y fiable para extensas pruebas de hemocompatibilidad de stents y otros dispositivos de contacto con la sangre antes de la aplicación clínica.
Introduction
La aplicación in vivo de implantes y biomateriales, que interactúan con la sangre humana, requiere pruebas preclínicas intensas centradas en la investigación de varios marcadores del sistema hemostático. La Organización Internacional de Normalización 10993-4 (ISO 10993-4) especifica los principios centrales para la evaluación de los dispositivos de contacto con la sangre (es decir, stents e injertos vasculares) y considera el diseño del dispositivo, la utilidad clínica y los materiales necesarios1.
La sangre humana es un líquido que contiene varias proteínas plasmáticas y células, incluyendo leucocitos (glóbulos blancos [WBCs]), eritrocitos (glóbulos rojos [RBR]), y plaquetas, que llevan a cabo funciones complejas en el cuerpo humano2. El contacto directo de materiales extraños con la sangre puede causar efectos adversos, como la activación del sistema inmunológico o de coagulación, que puede conducir a inflamación o complicaciones trombóticas y problemas graves después de la implantación3,4,5. Por lotanto, la validación de la hemocompatibilidad in vitro ofrece una oportunidad antes de la implantación para detectar y excluir cualquier complicación hematológica que pueda inducirse al contacto de la sangre con una superficie extraña6.
El modelo de bucle de flujo presentado se estableció para evaluar la hemocompatibilidad de stents neurovasculares y dispositivos similares mediante la aplicación de un caudal de 150 ml/min en tubos (diámetro de 3,2 mm) para imitar las condiciones de flujo cerebral y los diámetros de las arterias2,7. Además de la necesidad de un modelo in vitro óptimo, la fuente de sangre es un factor importante para obtener resultados fiables e inalterados al analizar la hemocompatibilidad de un biomaterial8. La sangre recogida debe utilizarse inmediatamente después del muestreo para evitar cambios causados por un almacenamiento prolongado. En general, se debe realizar una suave acumulación de sangre sin éxtasis utilizando una aguja de 21 G para minimizar la preactivación de las plaquetas y la cascada de coagulación durante la elaboración de sangre. Además, los criterios de exclusión de los donantes incluyen a aquellos que fuman, están embarazadas, están en mal estado de salud o han tomado anticonceptivos orales o analgésicos durante los 14 días anteriores.
Este estudio describe un modelo in vitro para las extensas pruebas de hemocompatibilidad de implantes de stent en condiciones de flujo. Al comparar stents recubiertos sin recubrimiento con fibrina heparina, los resultados de las pruebas de hemocompatibilidad integrales reflejan una hemocompatibilidad mejorada de los stents recubiertos con fibrina-heparina9. Por el contrario, los stents sin recubrimiento inducen la activación de la cascada de coagulación, como lo demuestra un aumento de las concentraciones de thombin-antitrombina III (TAT) y la pérdida de números de plaquetas en sangre debido a la adhesión de plaquetas a la superficie del stent. En general, se recomienda integrar este modelo de hemocompatibilidad como prueba preclínica para detectar cualquier efecto adverso en el sistema hemostático causado por el dispositivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado describe un método completo y confiable para la prueba de hemocompatibilidad de implantes que contactan la sangre de acuerdo con la ISO 10993-4 en un modelo de flujo de cizallamiento que imita el flujo sanguíneo humano. Este estudio se basa en la prueba de implantes neurovasculares cortados por láser, pero se puede realizar con una variedad de muestras. Los resultados demuestran que este método permite el análisis amplio de diversos parámetros como el recuento de células sanguíneas, la pre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Por el desempeño de la microscopía electrónica de escaneo, agradecemos a Ernst Schweizer de la sección de Ciencia y Tecnología de Materiales Médicos del Hospital Universitario tuebingen. La investigación fue apoyada por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes del CR dentro del Programa Nacional de Sostenibilidad II (Proyecto BIOCEV-FAR LQ1604) y por el proyecto No 18-01163S de la Fundación Checa de Ciencias.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
Riferimenti
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