Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound
Summary
Ici nous présentons une méthode de criblage pour la pyrophosphatase membran-liée (de Thermotoga maritima) inhibiteurs basés sur la réaction bleue de molybdène dans un format 96 de plaque de puits.
Abstract
Les pyrophosphatases membranaires (mPPases) sont des enzymes dimériques qui se produisent dans les bactéries, les archées, les plantes et les parasites protistes. Ces protéines censent le pyrophosphate en deux molécules d’orthophosphate, qui est couplée avec le proton et/ou le pompage d’ion de sodium à travers la membrane. Comme aucune protéine homologue ne se produit chez les animaux et les humains, les mPPases sont de bons candidats dans la conception de cibles médicamenteuses potentielles. Ici nous présentons un protocole détaillé pour examiner les inhibiteurs de mPPase utilisant la réaction bleue de molybdène dans un système de plaque de puits 96. Nous utilisons le mPPase de la bactérie thermophile Thermotoga maritima (TmPPase) comme enzyme modèle. Ce protocole est simple et peu coûteux, produisant un résultat cohérent et robuste. Il ne faut qu’environ une heure pour compléter le protocole d’etoile d’activité depuis le début de l’assiduité jusqu’à la mesure de l’absorption. Étant donné que la couleur bleue produite dans cet analyse est stable pendant une longue période de temps, l’analyse ultérieure peut être effectuée immédiatement après le lot précédent, et l’absorption peut être mesurée plus tard pour tous les lots à la fois. L’inconvénient de ce protocole est qu’il est fait manuellement et peut donc être épuisant ainsi que nécessitent de bonnes compétences de pipetage et de temps. De plus, la solution de citrate d’arsenit utilisée dans cet assay contient de l’arsénite de sodium, qui est toxique et doit être manipulée avec les précautions nécessaires.
Introduction
Environ 25 % des protéines cellulaires totales sont des protéines membranaires et environ 60 % d’entre elles sont des cibles médicamenteuses1,2. L’une des cibles médicamenteuses potentielles3, pyrophosphatases membranaires (mPPases), sont des enzymes dimériques qui pompent le proton et/ou l’ion de sodium à travers la membrane par hydrolyse de pyrophosphate en deux orthophosphates4. mPPases peut être trouvé dans divers organismes5 tels que les bactéries, archées, plantes, et les parasites protistes, à l’exception des humains et des animaux4. Chez les parasites protistes, par exemple Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii et Trypanosoma brucei, mPPases sont essentiels pour la virulence parasite6 et KO de cette expression dans les parasites conduire à l’échec dans le maintien du pH intracellulaire lors de l’exposition au pH de base externe7. En raison de leur importance et du manque de protéines homologues présentes chez les vertébrés, les mPPases peuvent être considérés comme des cibles médicamenteuses potentielles pour les maladies protistales3.
Le dépistage in vitro des inhibiteurs du mPPase dans ce travail est basé sur un système de modèle TmPPase. TmPPase est un pompage d’ion de sodium et de potassium ion dépendant mPPase de T. maritima et a son activité optimale à 71 c8. Les avantages de cette enzyme sont par exemple sa facilité de production et de purification, une bonne stabilité thermique et une activité spécifique élevée. TmPPase montre à la fois une forte similitude en plus de la conservation complète de la position ainsi que l’identité de tous les résidus catalytiques à la mPPases protiste3,9 et à la structure résolue de Vigna radiata10 mPPase. Les structures disponibles de TmPPase dans différentes conformations sont également utiles pour l’expérience de conception de médicaments basée sur la structure (comme le dépistage virtuel et la conception de novo).
Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage des inhibiteurs de TmPPase dans un format de plaque de puits 96 (figure 1). Le protocole est basé sur la méthode colorimétrique de la réaction bleu molybdène, qui a d’abord été développé par Fiske et Subbarow11. Cette méthode implique la formation d’acide phosphomolybdique 12-phosphomolybd à partir d’orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides, qui est ensuite réduite pour donner des espèces caractéristiques de phosphomolybdène de couleur bleue12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage simple des inhibiteurs pour la pyrophosphatase membranaire-liée de T. maritima dans un format 96 de plaque de puits basé sur Vidilaseris et autres14. Ce protocole est peu coûteux et basé sur l’acide 12-phosphomolybd, qui est formé à partir d’orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides et réduit à des espèces de phosphomolybdène avec une couleur bleue distincte12. Cette méthode es…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation Jane et Aatos Erkko et du BBSRC (BB/M021610) à Adrian Goldman, l’Académie de Finlande (no 308105) à Keni Vidilaseris, (no 310297) à Henri Xhaard, et (no 265481) à Jari Yli-Kauhaluoma, et les fonds de recherche de l’Université d’Helsinki à Gustav Boije af Genns. Les auteurs remercient Bernadette Gehl pour son aide technique pendant le projet.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
Riferimenti
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